Impact of the CCN-proteins CYR61/CCN1 and WISP3/CCN6 on mesenchymal stem cells and endothelial progenitor cells

• Main Author: Schenk, Rita
• Format: Doctoral Thesis
• Language: English
• Published: 2007
• Subjects: Endothel; ddc:570
• Online Access: https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/frontdoor/index/index/docId/2399; http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-27766; https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bvb:20-opus-27766; https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/2399/Schenkdiss.pdf

CYR61 and WISP3 belong to the family of CCN-proteins. These proteins are characterised by 10% cysteine residues whose positions are strictly conserved. The proteins are extracellular signalling molecules that can be associated with the extracellular matrix. CCN-proteins function in a cell- and tissue specific overlapping yet distinct manner. CCN-proteins are expressed and function in several cells and tissues of the musculoskeletal system. In this study the impact of the angiogenic inducer cysteine-rich protein 61 (CYR61/CCN1) on endothelial progenitor cells (EPCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) as well as the wnt1 inducible signalling pathway protein 3 (WISP3/CCN6) on MSCs were elucidated. EPCs are promising cells to induce neovascularisation in ischemic regions as tissue engineered constructs. A major drawback is the small amount of cells that can be obtained from patients; therefore a stimulating factor to induce in vitro propagation of EPCs is urgently needed. In this study, mononuclear cells obtained from peripheral blood were treated with 0.5 µg/ml CYR61, resulting in an up to 7-fold increased cell number within one week compared to untreated control cells. To characterise if EPCs treated with CYR61 display altered or maintained EPC phenotype, the expression of the established markers CD34, CD133 and KDR as well as the uptake of acLDL and concurrent staining for ulex lectin was analysed. Both CYR61 treated and untreated control cells displayed EPCs characteristics, indicating that CYR61 treatment induces EPC number without altering their phenotype. Further studies revealed that the stimulating effect of CYR61 on EPCs is due to enhanced adhesion, rather than improved proliferation. Usage of mutated CYR61-proteins showed that the adhesive effect is mediated, at least partly, by the integrin α6β1, while the integrin αυβ3 has no influence. Endogenous expression of CYR61 was not detectable in EPCs, which indicated that control cells are not influenced by endogenous secretion of CYR61 and also could explain the dose-dependent effect of CYR61 that is measured at a low concentration of 0.05 µg/ml. MSCs were treated with 0.5 µg/ml CYR61, a combination of growth factors including VEGF, both together and compared to untreated control cells. Matrigel angiogenesis assay revealed an induction of angiogenesis, detected by induced sprouting of the cells, after CYR61 treatment of the MSC. Induced sprouting and vessel like structure formation after CYR61 treatment was similar to the results obtained after treatment with growth factors including the established angiogenesis inducer VEGF. This result clearly demonstrates the angiogenic potential of CYR61 on MSCs. Further studies revealed a migrative and proliferative effect of CYR61 on MSCs. Both properties are crucial for the induction of angiogenesis thus further strengthening the view of CYR61 as an angiogenic inducer. MSCs and EPCs are promising cells for tissue engineering applications in bone remodelling and reconstruction. MSCs due to their potential to differentiate into other lineages; EPCs induce neovascularisation within the construct. Both cell types respond to CYR61 treatment. Furthermore EPCs home to sides were CYR61 expression is detectable and both are induced by similar stimulators. Therefore CYR61 is a promising factor for tissue engineered bone reconstruction applications. WISP3 is expressed in cartilage in vivo and in chondrocytes in vitro. Loss of function mutations in the WISP3 gene are associated to the inherited human disease progressive pseudorheumatoid dysplasia (PPD), that is characterised by cartilage loss and bone and joint destruction. Since MSCs also express the protein, the aim of this study was to elucidate if recombinant protein targets MSCs. A migratory effect of WISP3 treatment on MSCs and osteogenic differentiated MSCs has been proven in this study. To elucidate if global gene expression patterns are influenced by WISP3, cells were treated with 0.5 µg/ml WISP3 and compared to untreated control MSCs. Gene expression study by using affymetrix technology revealed an induction of interferon inducible genes including CXCL chemokines and members of the TNFSF family. Reevaluation by RT-PCR on identical RNA and an additional time series confirmed the results. Although no established cartilage associated genes were detected as regulated genes within this 24h treatment, anti-angiogenic and immunosuppressive genes indicate a protective role of WISP3 for the cartilage, which is sensitive to inflammatory processes. Both CCN-proteins CYR61 and WISP3 are valuable for the musculoskeletal system. This and previous studies revealed the role of CYR61 for osteogenesis and angiogenesis of tissue engineered applications. WISP3 is responsible for development, protection and maintenance of cartilage. Therefore further studies with the proteins in the musculoskeletal system are of high relevance. === CYR61 und WISP3 gehören zur Familie der CCN-Protein. Diese Proteine werden durch ihre Cysteinreste charakterisiert die10 % der Proteine ausmachen und hoch konserviert sind. Die Proteine sind extrazelluläre Signalmoleküle und können an die extrazelluläre Matrix gebunden sein. CCN-Proteine wirken Zell- und Gewebeabhängig in einer spezifischen und doch überlappenden Weise. CCN-Proteine werden exprimiert und wirken gleichzeitig in einigen Zellen und Geweben des muskoloskeletalen Systems. In dieser Arbeit wurde der Einfluss des angiogen wirkenden Cystein-reichen Proteins 61 (CYR61/CCN1) auf endotheliale Progenitorzellen (EPCs) und mesenchymale Stammzellen (MSCs), sowie die Wirkung vom wnt indizierbaren Signalweg Protein 3 (WISP3/CCN6) auf MSCs untersucht. EPCs sind viel versprechende Zellen für die Behandlung und Neovaskularisierung von Ischämien wie zum Beispiel in Konstrukten aus dem Tissue Engineering. Von Nachteil ist die geringe Zellzahl, die von einem Patienten gewonnen werden kann. Aus diesem Grund ist ein Stimulator notwendig, der die in vitro Vermehrung der Zellen induziert. In dieser Studie wurden mononukleäre Zellen aus dem peripheren Blut von Spendern mit 0,5 µg/ml CYR61 behandelt. Die Zellzahl der CYR61 behandelten Zellen nahm innerhalb von einer Woche um das 7-fache im Vergleich zu den unbehandelten Zellen zu. Um die CYR61 behandelten EPCs zu charakterisieren wurde die Expression der etablierten Oberflächenmarker CD34, CD133 und KDR sowie die Aufnahme von acLDL mit der gleichzeitigen Anfärbbarkeit für Ulex lektin untersucht. Sowohl die CYR61 behandelten als auch die unbehandelten Zellen zeigten die charakteristischen Merkmale für EPCs. Somit ist der Nachweis erbracht, dass die EPC Zellzahl durch die CYR61 Behandlung erhöht wird ohne den Phänotyp der Zellen zu ändern. Weitere Studien ergaben dass der beobachtete Effekt eher auf verstärkter Adhäsion an die Zellkulturoberfläche als auf eine Induktion der Proliferationsrate beruht. Die Verwendung von mutierten CYR61 Proteinen zeigte, dass der adhäsive Effekt zumindest zum Teil über das Integrin α6β1 vermittelt wird, während das Integrin αυβ3 keinen Effekt zu haben scheint. Eine endogene Expression von CYR61 in EPCs konnte nicht nachgewiesen werden, was die Ansprechbarkeit der EPCs schon bei niedrigen dosis-abhängigen Konzentrationen von 0,05 µg/ml erklären könnte. MSCs wurden mit 0,5 µg/ml CYR61, einer Kombination von Wachstumsfaktoren inklusive VEGF und beiden zusammen behandelt und mit unbehandelten Kontrollzellen verglichen. Im Matrigel Angiogenese Assay konnte die Induktion von Angiogenese, ermittelt durch die Induktion der Zellsprossung, durch die Behandlung der MSCs mit CYR61 nachgewiesen werden. Die beobachtete Sprossung und Bildung von Gefäß-ähnlichen Strukturen nach der CYR61 Behandlung war dem Effekt nach der Behandlung mit Wachstumsfaktoren inklusive dem etablierten angiogenen Stimulator VEGF ähnlich. Dieses Ergebnis ist der Beweis für das angiogene Potential von CYR61 auf MSCs. Weitere Studien bewiesen einen migrativen und proliferativen Effekt von CYR61 auf MSCs. Beide Eigenschaften sind entscheidend für die Induktion von Angiogenese, wodurch das Bild von CYR61 als angiogener Induktor verstärkt wird. MSCs und EPCs sind viel versprechende Zellen für die Rekonstruktion und den Umbau von Knochen mittels Tissue Engineering. MSCs durch ihr Potential in verschiedene Richtungen zu differenzieren und EPCs durch die Möglichkeit der Neovaskularisierung der besiedelten Konstrukte. Beide Zellarten reagieren auf CYR61 Behandlung. Weiterhin akkumulieren EPCs an ähnlichen Stellen im Körper an denen CYR61 exprimiert wird. Außerdem werden beide durch die gleichen Faktoren stimuliert. Deshalb stellt CYR61 einen viel versprechenden Faktor für Knochenrekonstruktions-Anwendungen mittels Tissue Engineering dar. WISP3 wird in vivo im Knorpel und in vitro in Chondrozyten exprimiert. Außerdem sind Funktionsverlust-Mutationen im WISP3-Gen mit der vererbten Krankheit Progressive Pseudorheumatoide Dysplasie (PPD) assoziiert. Die Krankheit ist durch den Verlust von Knorpel und dem Abbau von Knochen gekennzeichnet. MSCs exprimieren WISP3, aus diesem Grund sollte in der Studie geklärt werden welche Wirkung das rekombinate Protein auf MSCs hat. Ein migratorischer Effekt von WISP3 auf MSCs und osteogen differenzierte MSCs wurde in dieser Studie nachgewiesen. Um den Einfuß der WISP3 Behandlung auf das globale Genexpressionsmuster der MSCs zu ermitteln, wurden diese mit 0,5 µg/ml WISP3 behandelt und mit unbehandelten Zellen verglichen. Genexpressionsstudien mittels Affymetrix Technologie zeigte eine Induktion von interferon stimulierten Genen, unter anderem CXC Chemokine und Mitglieder der TNFSF Familie. Die Ergebnisse wurden durch RT-PCR an identischer RNA und einer zusätzlichen Zeitreihe bestätigt. Obwohl keine eindeutig knorpelrelevanten Gene detektiert wurden, stellen die gefundenen anti-angiogen und immunsupressiv wirkende Gene eine schützende Funktion für den im Zusammenhang mit immuninflamtorischen Prozessen empfindlichen Knorpel dar. Sowohl CYR61 als auch WISP3 sind wichtig für das muskoloskeletale System. Diese und vorherige Studien haben gezeigt das CYR61 einen Einfluss auf die Osteogenese und Angiogenese vom MSCs hat. WISP3 ist verantwortlich für die Entwicklung, den Schutz und Erhalt von Knorpel. Deshalb sollten weitere Studien zur Funktionsaufklärung der Proteine im muskoloskeltalen System durchgeführt werden.