Funktionelle Charakterisierung von Parathormon-Rezeptor Mutanten im Xenopus Oozyten-Expressionssystem

• Main Author: Hasse, Stephanie
• Format: Doctoral Thesis
• Language: deu
• Published: 2019
• Subjects: Rezeptor; ddc:616
• Online Access: https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/frontdoor/index/index/docId/17861; http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-178613; https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bvb:20-opus-178613; https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/17861/Hasse_Stephanie_PTH1R.pdf

G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) regulieren eine Vielzahl physiologischer als auch pathophysiologischer Prozesse im menschlichen Körper. Verankert in der Zellmembran vermitteln sie die Transduktion äußerer Stimuli zur Aktivierung nachgeschalteter Signalwege. Durch die Aktivierung Adenylatcyclasen-, Phosphlipasen C- und Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK)- abhängiger Signalwege, vermittelt der zur Familie B der GPCRs gehörige Parathormon-Rezeptor PTH1R die endokrine und parakrine Wirkungen des Parathormons (PTH) und des Parathormon-verwandten Proteins (PTHrP). Diese sind die Regulation der Kalzium-Homöostase, des Knochenmetabolismus und der Skelettentwicklung. In dieser Arbeit wurden vier Mutationen im PTH1-Rezeptor untersucht, die durch Roth und Mitarbeiter (2014) in den Zusammenhang mit dem Krankheitsbild der primären Zahndurchbruchsstörung (PFE) gebracht wurden. Die vier untersuchten Mutanten sind PTH1R [P119L], PTH1R [H442D], PTH1R [L232R] und PTH1R [L292P]: Bei den durch Mutagenese herbeigeführten Punktmutationen handelt es sich jeweils um eine missense-Mutation, bei der der Austausch einer einzelnen Base in der DNA-Sequenz zum Einbau einer anderen Aminosäure im Protein führt. Es folgte die funktionelle Charakterisierung des Parathormon-Rezeptors und seiner Mutanten, welche auf einer indirekten Messung der Rezeptoraktivität basierte. Direkt gemessen wurden dabei die Kaliumströme der Tandemporen-Kaliumkanäle TASK-1 und TRESK, welche durch Gq-Protein gekoppelte Rezeptoren reguliert werden können: So werden TASK-Ströme durch GPCRs inhibiert, TRESK-Ströme dagegen aktiviert. TASK-1 Kanäle und Parathormon-Rezeptoren wurden zeitgleich heterolog in Xenopus laevis Oozyten exprimiert und anschließend mittels der Zwei-Elektroden-Spannungsklemme (TEVC) elektrophysiologisch untersucht. Nach Zugabe von PTH (100 nM) ergab sich nach Kopplung an den TASK-1 Kanal für den PTH1R-Wildtyp eine durchschnittliche Stromamplitude von 52,11 % ± 3,60 % (n=28). Dagegen zeigten sich für die PTH1R-Mutanten keine signifikanten Änderungen der Stromamplituden nach Zugabe der PTH-haltigen Messlösung. Die Untersuchungen wurden mit dem TRESK-Kanal wiederholt. Hier zeigte sich eine deutliche TRESK-Aktivierung durch Kopplung an den PTH1R-Wildtyp beim Einwaschen von PTH. Bei den Mutanten kam es ebenfalls nicht zu einer signifikanten Änderung der Stromamplitude durch PTH-Zugabe. Ein Austausch dieser entsprechenden Aminosäuren führt somit zu einem Funktionsverlust des Parathormon-Rezeptors Typ 1. Bei den untersuchten Mutationen handelt es sich daher um Loss-of-function-Mutationen. Diese Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass die von Roth und Mitarbeitern in ihrer Pathogenität als „wahrscheinlich schädlich“ eingestuften Mutationen durch die vorliegende Arbeit nun als „pathogen“ und damit PFE-verursachend bezeichnet werden können. Die zahnmedizinische Relevanz dieser Ergebnisse liegt darin begründet, dass durch eine genetisch gesicherte Diagnose PFE, die korrekte und erfolgversprechendste Behandlungsoption gewählt werden kann. Von PFE betroffene Zähne ankylosieren nach Applikation kieferorthopädischer Kräfte und können nicht weiter bewegt werden. Somit kann nach der Diagnose PFE ein individuelles Behandlungskonzept erstellt werden, das sich nach dem Ausmaß der Durchbruchsstörung richtet. Langjährige und frustrierende kieferorthopädische Behandlungen bleiben dem Patienten, aber auch dem Kieferorthopäden erspart. === Functional characterisation of parathyroid hormone receptor mutants in the xenopus oocyte expression system: Heterozygous mutations of the parathyroid hormone receptor (PTH1R) gene are causally linked to primary failure of tooth eruption (PFE).