Die Rolle der Mangansuperoxiddismutase bei der Kohlenstoffmonoxid vermittelten Protektion in der systemischen Inflammation im murinen Maustiermodell

• Main Author: Brugger, Jürgen
• Format: Doctoral Thesis
• Language: deu
• Published: 2015
• Subjects: Entzündung; ddc:610
• Online Access: https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/frontdoor/index/index/docId/13741; http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-137410; https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bvb:20-opus-137410; https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/13741/Brugger_Juergen_Dissertation-MnSOD.pdf

Fragestellung: Die Leberdysfunktion im Rahmen einer systemischen Inflammation stellt einen der wichtigsten Faktoren dar, welcher die Letalität erhöht. Sauerstoffradikale (ROS) sind zytotoxisch und wichtige Mediatoren in der Pathophysiologie der entzündlichen Leberschädigung. Dies war bereits Gegenstand vieler Arbeiten. Kohlenstoffmonoxid (CO), ein Produkt der Katalyse von Häm via Hämoxygenase (HO), wirkt zytoprotektiv gegen entzündliche Prozesse. In der vorliegenden Studie untersuchten wir in der Leber die Wirkungsweise von CO auf das Antioxidans Mangan-Superoxiddismutase (MnSOD) in einem Tiermodell der systemischen Entzündungsreaktion. Methodik: Nach Einverständnis der Tierschutzkommission wurden männliche Mäuse (C57/BL6) mit Isoflurane narkotisiert und zur Messung des mittleren arteriellen Blutdruck (MAP) instrumentiert. Ein normotensives SIRS wurde mit Hilfe einer beidseitigen Ischämie der Hinterläufe für 60 Minuten und nachfolgender Reperfusion (I/R) für 3 Stunden induziert. Die Hämoxygenaseaktivität wurde mit Haem induziert und mittels Chromium Mesoporphyrin (CrMP) kompetetiv gehemmt. Ein Teil der Tiere inhalierte CO (250 ppm) nach Beginn der Reperfusion oder erhielt Methylenchlorid (MC, i.p.) zur Induktion der endogenen hepatischen CO Produktion. Die Fettsäurenoxidation (Malondialdehyde, MDA) und die Gewebespiegel für Glutathione (GSH) wurden mittels spezifischen Enzymessays bestimmt. ROS-Bildung konnte mittels intravitaler Fluoreszenzmikroskopie und dem Farbstoff Dihydrorhodamine (DHR) quantifiziert werden. Das Lebergewebe wurde in sinusoidale und parenchymale Zellfraktionen aufgetrennt. Die Mangan-Superoxiddismutase (MnSOD) Aktivität und Proteinmenge wurde in der sinusoidalen und parenchymalen Zellfraktion mittels Western Blot analysiert. Die Karbonylierung ist eine inaktivierende oxidative Proteinmodifikation. Das Ausmaß der Karbonylierung von MnSOD in den Zellfraktionen wurde mittels Immuno-Blot (OxyBlot; Chemicon) untersucht. Die statistische Testung erfolgte mittels Kruskal-Wallis Test, wobei p<0,05 signifikant war. Ergebnisse: I/R Tiere zeigten signifikant mehr DHR-Fluoreszenz, mehr MDA-Bildung und weniger GSH als Sham Tiere (p<0.02). I/R+CrMP Behandlung hatte signifikant am meisten oxidativen Stress im Vergleich zu allen Behandlungsgruppen zur Folge. Die Inhalation von CO oder die Injektion von MC nach I/R reduzierte die DHR-Fluoreszenz, MDA-Bildung und normalisierte die GSH Spiegel im Vergleich zu I/R Tieren. I/R+CrMP+CO Behandlung zeigte die gleichen Ergebnisse wie I/R+CO Behandlung. Die parenchymale Zellfraktion der Leber zeigte keine Veränderung der MnSOD. In der sinusoidalen Zellfraktion fand sich keine Veränderung der MnSOD Proteinmenge. Jedoch reduzierte sich die sinusoidale MnSOD Aktivität signifikant nach I/R (p<0.02), erholte sich aber nach I/R+CO Behandlung wieder auf Sham Niveau. Die Karbonylierung von MnSOD nach I/R war signifikant erhöht in der sinusoidalen Zellfraktion. Nach I/R+CO konnte eine Reduktion der Karbonylierung von MnSOD auf das Sham Niveau nachgewiesen werden. Interpretation: CO reduziert signifikant den hepatischen oxidativen Stress in der systemischen Inflammation. CO induziert die Aktivität der MnSOD in den sinusoidalen, nicht jedoch in den parenchymalen Zellen der Leber. Es konnte in der systemischen Entzündungsreaktion gezeigt werden, dass CO die antioxidative Wirkung von MnSOD durch eine Hemmung der Karbonylierung in den sinusoidalen Zellen der Leber induziert. Diese Ergebnisse zeigen erstmals, über die Karbonylierung von MnSOD, einen indirekten antioxidativen Effekt von CO. Welche weiteren Enzymsysteme von CO auf diese Weise beeinflusst werden, müssen weitere Untersuchungen zeigen. === Objective:  The dysfunction of the liver in scope of systemic inflammation is an important factor, which increase the lethality. Reactive oxygen species (ROS) are cytotoxic and important mediators in the pathophysiology of the inflammatory liver damage. Carbon monoxide (CO), a product of the catalysis of hem via hem oxygenase, is zytoprotectiv against inflammatory processes. We examined the role of CO on the antioxidant Mangan-Superoxiddismutase (MnSOD) in a murine animal model of systemic inflammation. Methods:  The study was carried out in strict accordance with the recommendation in the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals of the National Institutes of Health. After animal care committee approval male mice (C57/BL6) were give an anesthesia with Isoflurane. A continuous blood pressure measurement was installed. A normotensive SIRS was induced by means of bilateral hind limb ischemia-reperfusion (I/R). Activity of hem oxygenase was induced by hem and competitive inhibited by Chromium Mesoporphyrin (CrMP). A part of the animals inhaled CO (250 ppm) after the beginning of the reperfusion or got Methylenchlorid (MC, i.p.) for induction of the endogenous hepatic production of CO. Oxidation of the fatty acids (Malondialdehyde, MDA) and the tissue level of Glutathione (GSH) were diagnosed by specific enzyme essays. Production of ROS was quantified via intravital microscopy and the dye Dihydrorhodamine. Liver tissue was separated in parenchymal and sinusoidal cell fractions. MnSOD activity and -quantity was separate analyzed in sinusoidal and parenchymal cell fractions via western blot. Level of Carbonylation of MnSOD was analyzed by Immuno-Blot (OxyBlot; Chemicon). As statistical test the Kruskal-Wallis-Test was used, in which p<0.05 was significant. Results: I/R-Animals shows significant more DHR-fluorescence, more generation of MDA and less GSH as sham-animals (p<0.02.). Treatment with I/R+CrMP result in most oxidative stress compared with all other groups. Inhalation of CO or the injection of MC after I/R reduced the DHR-fluorescence, generation of MDA and normalized the Level of GSH compared with I/R-groups. Treatment with I/R+CrMP+CO gives approximately equivalent results like I/R+CO. The parenchymal cell fraction shows not a change of MnSOD. Sinusoidal cell fraction shows no chance of quantity, but a significant reduced activity of MnSOD after I/R (p<0.02). After treatment with I/R+CO the MnSOD activity recovered to sham level. Carbonylation of MnSOD was significant elevated in the sinusoidal cell fraction. After I/R+CO the Carbonylation show a reduction to sham level. Conclusions: CO reduces significant the hepatic oxidant stress in systemic inflammation. CO has direct antioxidant potential independently of any HO activity during systemic inflammation. CO induces the activity of MnSOD in sinusoidal, but not in parenchymal cells of the liver. This results show that the inhibition of the carbonylation of the MnSOD looks like an indirect antioxidant effect of CO. Which other enzyme systems are influenced by CO is the object of further studies.