Endozytose des Ca2+-sensitiven hIK1-Kanals in migrierenden MDCK-F-Zellen

• Main Author: Römer, Michael
• Format: Doctoral Thesis
• Language: deu
• Published: 2005
• Subjects: ddc:610
• Online Access: https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/frontdoor/index/index/docId/1357; http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-15750; https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bvb:20-opus-15750; https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/files/1357/PromDruckVersion.pdf

Zellmigration ist ein wichtiges Phänomen im gesamten Leben eines menschlichen Organismus. Erwünschte physiologische Bedeutung hat die Zellmigration z. B. im Rahmen der Embryogenese, der Wundheilung und der Immunabwehr, während sie pathophysiologisch unter anderem bei der Metastasierung maligner Neoplasien in Erscheinung tritt. Für optimale Migration ist eine Beteiligung von Ionenkanälen, Ionentransportern und zytoskeletalen Mechanismen in streng koordinierter Interaktion notwendig. Bei selektiver Blockade Ca2+-sensitiver K+-Kanäle (IK1) durch das Skorpiongift Charybdotoxin wird die Migrationsfähigkeit von Zellen erheblich gestört. Da dies ein möglicher thera-peutischer Ansatzpunkt zur Malignitätsreduzierung von Tumoren durch Hemmung der Metastasierung sein könnte, galt es in dieser Arbeit, den „Lebenslauf“ dieses Kanalproteins genauer zu erforschen. Bisherige Erkenntnisse über Migrationsmechanismen, Membran-Umbau und Integrintransport wurden in einem neuen Modell zusammengefasst, das unter anderem die Theorie des K+-Kanal-Rezirkulierens beinhaltet. Zur Überprüfung dieser Theorie wurde in der vorliegenden Doktorarbeit auf die Endo-zytose der Ca2+-abhängigen K+-Kanäle als ersten Schritt bei deren Rezirkulation fokussiert. Durch die Insertion eines viralen HA-Epitops in die Gensequenz des hIK1 mit PCR-Technik konnte der Kanal durch monoklonale anti-HA-Antikörper [Maus] markierbar und durch Zweitantikörper [anti-Maus] detektierbar gemacht werden. Nach der Transfektion des hIK1-HA-34-Plasmids in migrierende MDCK-F-Zellen war aufgrund der extrazellulären Lage des HA-34-Epitops im Kanalprotein eine Markierung der Kanäle mit Antikörpern in lebenden Zellen möglich. Die Immunfluoreszenzmikroskopie zeigte nach 37°C-in vivo-Inkubation der Zellen mit extrazellulärer hIK1-HA-34-Markierung die Bildung von vesikelähnlichen Strukturen, die auf Endozytose hindeuten konnten. Untransfizierte Kontrollzellen blieben ungefärbt – die Aufnahme der Antikörper in die Zellen mit hIK1-HA-34 musste also spezi-fisch über Endozytose der Antikörper-Kanal-Komplexe geschehen sein. In der in vivo-Inkubation bei 4°C waren die Versuchszellen nur schemenhaft zu erkennen und auch das bei den 37°C-Experimenten deutlich sichtbare „ruffling“ an der Lamellipodiumspitze stellte sich nicht dar. Dies erhärtete den Verdacht auf eine Ansammlung von Vesikeln an der Lamellipodiumvorderkante. Mit dem Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) konnte die K+-Kanalpräsenz in der Plasmamembran quantifiziert werden. Gegenüber den untransfizierten Kontrollzellen waren die Peroxidase-Werte um das achtfache erhöht. Dies weist ebenfalls auf eine spezifische Endozytose der hIK1-markierenden Antikörper hin. Zudem zeigte sich bei der 37°C-Inkubation im Zeitverlauf über 60 Minuten eine Sättigungskinetik, die ebenfalls für ein Rezirkulieren des hIK1 sprechen könnte. Zusammengefasst scheinen die Ergebnisse der verschiedenen Untersuchungstechniken die Endozytose Ca2+-empfindlicher K+-Kanäle als ersten Schritt eines vermuteten Rezirkulierens der Kanalproteine zu bestätigen. === The migration of cells depends on the cooperation of cytoskeletal mechanisms and ion channels like the Ca2+-sensitive K+-channel, which essential involvement already could be shown [Schwab A; J Clin Invest 1994;93:1631]. Considering the fast cellmembrane turn-over and the expensive production of channel proteins one can come to the conclusion, that it would be more economic to “recycle” ion channels using mechanisms like endo- and exocytosis. In order to get to know the movement and the fate of an exprimated K+-channel we inserted genetically a HA-tag into the extracellular 3-4-transmembrane-link to make the channel attachable in-vivo for anti-HA-antibodies, which could be detected by secondary TRITC- or HRP-conjugated antibodies (Immunofluorescence or ELISA). After incubation of transfected MDCK-F-cells for 30 and 60 minutes in-vivo (MEM+;37°C) the cell contour with its typical polarisation and appeared - contrary to non-transfected MDCK-F-wildtyp-cells, that were used for control. Moreover the well-known summation of marked Potassium-channels in the front-end formed and development of vesiclelike structures could be seen. With ELISA-technique an endocytosis of HA-tagged K+-channels could be measured, too, while non-transformed cells did not take up antibodies. The rising extinction of 60 minutes incubation in comparison to 30 minutes incubation could be an indication for a high rate of channel turn-over, perhaps equal to the fast turn-over of membrane lipides. This results support the theory of K+-channel-recycling by endocytosis and re-transportation to the front-end for new exocytosis.