Charakterisierung der physiologischen Bedeutung und der Wechselwirkungen der Sensoren des Zellintegritätswegs der Hefe Saccharomyces cerevisiae

• Main Author: Wittland, Janina
• Other Authors: Prof. Dr. Jürgen J. Heinisch
• Format: Doctoral Thesis
• Language: German
• Published: 2012
• Subjects: Zellintegrität; Hefe; Sensor; ddc:570
• Online Access: https://repositorium.ub.uni-osnabrueck.de/handle/urn:nbn:de:gbv:700-2012122110628

Veränderungen an der Zelloberfläche werden in der Hefe S. cerevisiae über die in der Plasmamembran lokalisierten Proteine Wsc1-Wsc3, Mid2 und Mtl1 wahrgenommen und intrazellulär über eine konservierte MAPK Kaskade innerhalb des Zellintegritätswegs („CWI Wegs“) weitergeleitet. Im Rahmen dieser Arbeit sollten sowohl die Sensoren dieses Signalwegs als auch die drei bekannten Rho1 GEFs Rom1, Rom2 und Tus1 näher charakterisiert und ihr mögliches Zusammenspiel am Beginn der Signalkaskade eingehend beleuchtet werden. Die Analyse der Sensor Einzeldeletionsstämme bestätigte die Annahme, dass Wsc1 und Mid2 die größte Bedeutung für die Aktivierung des CWI Wegs zukommt. Während Wsc1 jedoch aufgrund ausgeprägter Wachstumsdefekte der Einzeldeletion in erster Linie für die Antwort auf äußere Zellwandstress-auslösende Reize erforderlich zu sein scheint, wiesen die Ergebnisse der Wachstumsanalysen auf eine Hauptfunktion von Mid2 bei der Chitinsynthese der Zellen hin. Eine wichtige in vivo Funktion kommt darüber hinaus auch dem Sensor Wsc2 zu, dessen Funktionsverlust zu einer stark verringerten Fitness der entsprechenden Zellen in direkter Konkurrenz zu einem Wildtypstamm führte. Im Gegensatz zu den anderen Sensoren scheinen Wsc3 und Mtl1 für die Aktivierung des Zellintegritätswegs, zumindest während des vegetativen Wachstums, entbehrlich zu sein. Im Einklang mit der Funktion von Mid2 bei der Chitinsynthese konnte eine gleichmäßige, weitestgehend unbewegliche punktuelle Verteilung des Sensors innerhalb der Zelle detektiert werden. Wsc1 und Wsc2 wiesen dagegen eine polare Lokalisierung an Orten des gerichteten Zellwachstums auf, welche vermutlich durch Endozytose aufrechterhalten wird. So ging eine Beeinträchtigung des Internalisierungsprozesses nicht nur mit einer gleichmäßigen Verteilung und einer erhöhten Halbwertszeit dieser beiden Plasmamembranproteine, sondern auch mit einer stark verringerten Fitness der entsprechenden Zellen einher. Obwohl die Sensoren Wsc3 und Mtl1 ebenfalls an Orten des gerichteten Zellwachstums lokalisierten, war ihre polare Verteilung weniger ausgeprägt und unabhängig von der End3 vermittelten Endozytose. Die drei Rho1 GEFs waren ebenfalls polar in der Zelle verteilt. Dennoch konnten mittels Hefe Zwei-Hybrid-Analysen und bimolekularer Fluoreszenzkomplementation lediglich Interaktionen zwischen Rom2 und den Sensoren identifiziert werden, wobei die unterschiedlichen Wechselwirkungs-Orte innerhalb der Zelle auf spezifische, nicht überlappende Funktionen der Sensoren hinweisen. Einzig bei der Pheromon induzierten Morphogenese konnte eine Interaktion des GEFs mit allen Sensoren in den „Shmoo“-Spitzen der Zellen und folglich eine vermeintliche Redundanz der Plasmamembranproteine beobachtet werden. Neben den Erkenntnissen aus den Interaktionsstudien bekräftigten auch die weiteren im Rahmen dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse, dass Rom1 und Tus1 eigenständige Rollen zu besitzen scheinen und somit als mögliche Wechselwirkungspartner der Sensoren höchstwahrscheinlich ausgeschlossen werden können. Schließlich wurde mithilfe der bimolekularen Fluoreszenzkomplementation auch die postulierte Cluster Bildung des Sensors Wsc1 näher untersucht. Es zeigte sich, dass die Sensormoleküle direkt miteinander interagierten und vermutlich als Oligomere an Orten des polaren Wachstums detektierbar waren. Da die beobachtete Wechselwirkung durch die Mutation einzelner Cysteine der CRD nicht beeinträchtigt wurde, scheint diese Region zwar für die Cluster Bildung, aber nicht für die direkte Interaktion der Sensormoleküle erforderlich zu sein. Neben den Wsc1-Homooligomeren konnten im Rahmen dieser Arbeit zudem Wsc2 Homodimere und Wsc1/Wsc2-Heterodimere beobachtet werden, wobei die Verteilung der Sensordimere mit den Orten übereinstimmte, an welchen eine Wechselwirkung der beiden Plasmamembranproteine mit Rom2 detektiert werden konnte.