Improvement of Winter Oilseed Rape Resistance to Verticillium longisporum - Assessment of Field Resistance and Characterization of Ultrastructural Plant Responses

• Main Author: Knüfer, Jessica
• Other Authors: Tiedemann, Andreas von Prof. Dr.
• Format: Doctoral Thesis
• Language: English
• Published: 2013
• Subjects: 630; Oilseed rape; Verticillium longisporum; resistance breeding; quantitative real-time PCR; electron microscopy; Land- und Forstwirtschaft (PPN621302791)
• Online Access: http://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0001-BAA5-A; http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:gbv:7-11858/00-1735-0000-0001-BAA5-A-9

Die Intensivierung des Rapsanbaus in den letzten Jahren hat zu einem verstärkten Aufkommen des bodenbürtigen Gefäßpathogens V. longisporum geführt. Die für den Pilz charakteristischen Mikrosklerotien können langjährig im Boden überdauern, akkumulieren und somit zur fortdauernden Bodenkontamination führen. Eine Infektion mit V. longisporum kann bereits im Herbst erfolgen, wenn durch Wurzelexsudate stimulierte Mikrosklerotien auskeimen und direkt die Wurzelepidermis der Rapspflanze penetrieren. Einer sowohl intra-als auch interzellulär gerichteten Ausbreitung bis zu den Gefäßelementen schließt sich eine langanhaltende Phase des Pilzes im Gefäßsystem an. In dieser latenten Phase zeigen sich keine auffälligen Symptome an der Pflanze, erst zum Ende der Pflanzenentwicklung zeigt sich halbseitige Stängelverbräunung und vorzeitige Abreife kann zu Ertragseinbußen führen. Der Pilz bleibt so lange auf die Gefäße beschränkt bis die Pflanze in die Seneszenzphase eintritt. Dann erfolgt eine Besiedelung der angrenzenden parenchymatischen Zellen und die Bildung von Mikrosklerotien. Mit Pflanzenresten können diese wieder in den Boden gelangen. Da derzeit keine adequaten Pflanzenschutzmittel zur Verfügung stehen, ist der Anbau resistenter Sorten eine wirkungsvolle Maßnahme die Verbreitung des Pilzes einzudämmen und der Anreicherung von Mikrosklerotien im Boden entgegenzuwirken. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein entscheidender Beitrag zur Züchtung neuer resistenter Genotypen geleistet. Phänotypisierungen zur Identifizierung resistenter B. napus-Linien (darunter auch DH-Linien) erfolgten unter kontrollierten Bedingungen im Gewächshaus in Göttingen. Darüber hinaus wurde die Resistenz ausgewählter B. napus-Linien in zwei aufeinander folgenden Jahren anhand von Feldversuchen in Göttingen, an verschiedenen Standorten in Norddeutschland und an einem Standort in Südschweden evaluiert. Eine Untersuchung der von 2004 bis 2009 im Gewächshaus getesteten B. napus Akzessionen wurde hinsichtlich der Häufigkeitsverteilungen der berechneten normierten AUDPC-Werte betrachtet. So konnte deutlich gezeigt werden, dass sich das Resistenzlevel in den aktuellsten Screenings deutlich verbessert hat im Vergleich zum Beginn der Screenings. Die Reproduzierbarkeit der Screenings wurde deutlich durch die Betrachtung der normierten AUDPC-Werte der Referenzsorten ‘Falcon’ und ‘Express’. So waren die normierten AUDPC-Werte der mittelgradig resistenten Referenzsorte ‘Express’ durchgängig niedriger im Vergleich zu der anfälligen Sorte ‘Falcon’, was für die Robustheit der Methodik spricht. Der Vergleich zwischen Gewächshaus- und Feldversuchen zeigte, dass eine geringe Korrelation zwischen den im Feld und Gewächshaus getesteten Akzessionen besteht und macht die Komplexität der Untersuchungen deutlich. Ein Screening von Genotypen kann jedoch nur schnell und in großem Umfang unter Gewächshaus-Bedingungen erfolgen. Die erweiterte Testung im Feld ist dann jedoch nötig, um die Resistenz unter zusätzlichem abiotischem Stress zu evaluieren. Neben der Bewertung des Befallsgrades (Befallshäufigkeit, Befallsstärke) mittels Stoppelbonitur wurde eine alternative Bewertungsmethode zur Evaluierung der Resistenz im Feld kultivierter Rapspflanzen gegenüber V. longisporum entwickelt. Die Entwicklung einer sensitiven real-time PCR (qPCR)-Methode zur Detektion von V. longisporum in Rapsstängeln beinhaltete die Bewertung zweier unterschiedlicher Primer, abzielend auf die internal transcribed spacer (ITS) Region bzw. auf die β-Tubulin-Region, die hinsichtlich ihrer Sensitivität und Spezifität analysiert wurden. Die hier getesteten ITS-Primer wiesen eine hohe Sensitivität gegenüber genomischer Pilz-DNA auf, jedoch wurde keine Spezifität gegenüber V. longisporum Isolaten festgestellt; vielmehr wurden V. dahliae Isolate und zwei weitere Verticillium Arten mit ITS-Primern detektiert. Das zweite getestete Primerpaar zeigte hingegen eine hohe Spezifität gegenüber V. longsiporum Isolaten, lediglich 3 von 15 getesteten V. longisporum Isolaten wurden nicht erfasst. Die Sensitivität dieser Primer war jedoch im Vergleich zu den ITS-Primern stark verringert. Die ITS-basierte qPCR Analyse führte zur Detektion des Pathogens noch vor der Symptomausbildung im Feld. So konnte in der Saison 2008/09 am Standort Göttingen gezeigt werden, dass frühe Infektionen bereits zu BBCH 65 auftraten und innerhalb weniger Wochen eine massive Besiedelung anfälliger Sorten erfolgte. Zudem konnte die pilzliche DNA-Konzentration in infizierten Rapsstängeln verschieden anfälliger Sorten quantifiziert und eine Korrelation zwischen der herkömmlichen Stoppelbonitur und dem Screening im Gewächshaus hinsichtlich der Einordnung der Resistenzniveaus hergestellt werden. Dies unterstützt die Verwendung der molekularen Methode als Alternative zur Stoppelbonitur. Neben der Verbesserung der Detektion von V. longisporum im Feld wurde die Pathogen-Wirt-Interaktion hinsichtlich der Ausbildung von Resistenzmechanismen charakterisiert. Dazu wurden zwei verschieden anfällige B. napus-Linien nach Inokulation mit V. longisporum sowohl auf histologischer als auch auf molekularbiologischer Ebene im Hypokotylbereich untersucht. Dieser Abschnitt, der den Bereich vom Wurzelhals bis zum Keimblattansatz markiert, konnte in vorangegangenen Untersuchungen als Schlüsselgewebe für die Ausbildung von Resistenzstrukturen identifiziert werden (Eynck et al., 2009). Anknüpfend an diese Untersuchungen wurden mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) genotypabhängige Resistenzstrukturen wie Gefäßverschlüsse und morphologische Veränderungen des Gefäßbereiches untersucht und begleitende qPCR-Messungen dokumentierten die Pathogenausbreitung. Diese ließen erkennen, dass der anfällige Genotyp im Vergleich zum resistenten Genotyp schneller besiedelt wird. Jedoch zeigten beide mit V. longisporum inokulierten Genotypen ähnliche ultrastrukturelle Veränderungen im vaskulären Bereich. So konnten Veränderungen an vaskulären Zellwänden wie elektronendichte Ablagerungen und Degradation primärer Zellwände im Bereich der Tüpfel beobachtet werden. Zudem konnte das Verschließen von Gefäßelementen mittels gelartiger Strukturen nachgewiesen werden. Unsere Untersuchungen lassen vermuten, dass der resistente Genotyp fähig ist Infektionen schneller zu erkennen und Resistenzmechanismen zielgerichteter und intensiver zu aktivieren. Da eine V. longisporum-Infektion in dem untersuchten resistenten Genotyp SEM 05-500256 u. a. zu einer verstärkten Bildung von Gefäßbarrieren im Hypokotylbereich führt (Eynck et al., 2009), wurde eine Beeinträchtigung des pflanzlichen Wassertransportes vermutet. Zur Klärung dieser Frage wurde der resistente Genotyp zusätzlich zu einer Infektion mit V. longisporum Trockenstressbedingungen (30% Feldkapazität) ausgesetzt und physiologische Parameter (Gaswechselmessungen), Befallswerte (AUDPC, Stauchung) und agronomische Parameter (Phänologisches Entwicklungsstadium, Anzahl Seitentriebe, Ertragsparameter) erfasst und im Vergleich zu der anfälligen Sorte ‘Falcon’ evaluiert. Weder die Befallsparameter noch die agronomischen Parameter zeigten eine Beeinträchtigung der Resistenz von SEM bei V. longisporum-Infektion in Kombination mit Trockenstress an.