| Summary: | Secondary multidrug transporters use the energy stored in transmembrane ion gradients to bind and extrude a variety of weakly related chemical structures. These polyspecific antiporters challenge the notions of high-affinity conformation and strict ion-substrate coupling, inherent to the alternating-access model of transport. In order to investigate the mechanism of secondary multidrug transport at a molecular level, we study LmrP, a Major Facilitator Superfamily (MFS) multidrug transporter from Lactococcus lactis, which relies on the proton-motive force to achieve the transport of its diverse substrates. We carried out Double Electron Electron (DEER) distance measurements to elucidate the conformational dynamics underlying the transport cycle. We monitored the conformational response of a library of labeled double cysteine mutants to the presence of ligand(s) and proton(s). We investigated the role of the lipid environment by performing the measurements on mutants reconstituted in nanoscale soluble lipid bilayers (nanodiscs). During this work, we have demonstrated that the transporter oscillates between two main conformations, the outward-open and the inward-open. We have shown that the protonation of conserved acidic residues is the driving force of the conformational transition. The lipid bilayer modulates the equilibrium and allows the transition to occur at higher and more physiological pH values. By using specific lipid compositions, we observe that the lipid headgroup is crucial in the regulation of the conformational equilibrium. Based on our data, we propose a model of secondary multidrug transport wherein substrate binding initiates the transport cycle by catalysing proton entrance from the extracellular side. Subsequent protonation of membrane-embedded acidic residues triggers a cascade of conformational changes that results in substrate extrusion to the extracellular side and proton release in the cytosol. We suggest the opening and closing of the extracellular site is tightly regulated while the cytoplasmic side is more flexible. To our knowledge, this work provides the first direct structural evidence of the role of the lipids in the regulation of the conformational dynamics of a membrane transporter. === La surexpression de transporteurs capables d’expulser des molécules cytotoxiques est un mécanisme connu de résistance aux antibiotiques de la cellule bactérienne. Certains transporteurs ont développé la capacité de reconnaitre et d’expulser des substrats de structures diverses, donnant lieu à une résistance multidrogue de la part de leur hôte. Ces transporteurs multidrogues sont présents dans une variété de classes de protéines, distribués dans tous les règnes du vivant. Parmi celles - ci, la famille MFS (Major Facilitator Superfamily) comprend la majorité des transporteurs multidrogues activé par une source d’énergie secondaire, et jouent un rôle crucial dans la propagation de maladies nosocomiales d’origine bactérienne. Une meilleure compréhension des mécanismes fondamentaux du transport multidrogue secondaire est le prérequis indispensable à l’élaboration de thérapies adaptées. En particulier, une description détaillée des changements conformationnels impliqués dans le transport, et une identification des mécanismes moléculaires qui permettent de lier la source d’énergie au transport fait actuellement défaut. Afin de pallier ce manque, ce travail vise à étudier LmrP (Lactococcus lactis multidrug resistance Protein) un transporteur MFS qui confère à son hôte Lactococcus lactis la résistance à divers antibiotiques et agents cytotoxiques de structure et de charge variable. Cette extrusion active est alimentée par un cotransport énergétiquement favorable de protons. Nous avons étudié le mécanisme de transport de LmrP à l’échelle moléculaire en utilisant la technique spectroscopique Double Electron Electron Resonance (DEER), qui permet de mesurer des variations de distances à l’échelle nanométrique, idéale pour observer les mouvements intramoléculaires d’un transporteur MFS. Différents aspects moléculaires susceptibles de réguler le cycle de transport sont étudiés de façon indépendante et couplée :le rôle des protons, des différents substrats, et de l’environnement lipidique. Sur base de cette cartographie conformationnelle, un mécanisme de transport couplant tous les acteurs moléculaires est proposé :la liaison du proton à un motif d’acides aminés conservé constitue la base de la transition conformationnelle, les divers substrats ayant pour rôle de permettre aux protons d’accéder à ce motif. La compétition substrat-proton est la base du transport couplé. Notre travail a mis en évidence le rôle fondamental de l’environnement lipidique, qui module l’équilibre conformationnel du transporteur en interagissant avec un ou plusieurs motif(s) conservé(s). Par ailleurs, notre étude questionne le paradigme actuel de transport au sein de la famille MFS car elle démontre que les changements conformationnels globaux passent par des réarrangements locaux et coordonnés. === Doctorat en Sciences === info:eu-repo/semantics/nonPublished
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