Struktur und Funktion respiratorischer Cytochrom c-Sulfitreduktase-Systeme

• Main Author: Eller, Jakob
• Format: Others
• Language: de
• Published: 2019
• Online Access: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/9110/1/Jakob%20Eller_Dissertation%20final.pdf; Eller, Jakob <http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/view/person/Eller=3AJakob=3A=3A.html> (2019): Struktur und Funktion respiratorischer Cytochrom c-Sulfitreduktase-Systeme.Darmstadt, Technische Universität, DOI: 10.25534/tuprints-00009110 <https://doi.org/10.25534/tuprints-00009110>, [Ph.D. Thesis]

Sulfit bzw. Hydrogensulfit ist ein wichtiges Zwischenprodukt des Schwefelkreislaufs, als reaktive Schwefelverbindung aber auch ein Toxin. Das Epsilonproteobakterium Wolinella succinogenes verwendet für die Sulfit-Atmung und -Detoxifizierung die Oktahäm-Cytochrom c-Sulfit-Reduktase MccA, welche im mcc-Gencluster kodiert ist. Stromaufwärts von mccA sind die Gene des hypothetischen Zweikomponentensystems mccR und S lokalisiert. Stromabwärts von mccA liegen Gene, deren Produkte an der putativen Elektronentransportkette vom Chinonpool zu MccA beteiligt sein dürften (mccC und D), solche für die Reifung von MccA (mccB, ccsA1 und mccL) und solche mit unbekannter Funktion (mccE und F). Für den Elektronentransport zwischen respiratorischen Komplexen verwendet W. succinogenes Menachinon (MK) und dessen Derivat 8 Methylmenachinon (8-MMK), wobei letzteres aufgrund des negativeren Redoxpotentials des 8 MMK/8 MMKH2-Paares für die Sulfitatmung thermodynamisch günstiger ist. In dieser Arbeit wurde durch Leseraster-Mutation der Leserahmen von mccR in der Mutante W. succinogenes mccR+ cat verlängert, was im Gegensatz zum Wildstamm die gleichzeitige Atmung von Sulfit und Fumarat erlaubte. Derivate von W. succinogenes mccR+ cat mit einzelnen nichtpolaren Gendeletionen zeigten, dass mccB, C und D für die Sulfitatmung essenziell waren, während Zellen ohne mccL oder 8 MMK Sulfit mit verringerter Aktivität reduzierten. Die simultane Deletion von mccE und F hatte dagegen keinen Einfluss auf die Sulfitatmung. Eine Streptag-markierte Variante von MccA wurde unter der Kontrolle des mcc-Promotors in W. succinogenes produziert und gereinigt. Dessen Varianten, bei welchen eines der beiden Cu(I)-bindenden Cysteine durch Alanin ausgetauscht wurde, zeigten zwar dieselben spektroskopische Eigenschaften wie Wildstamm-MccA, waren zur Sulfitreduktion aber nicht in der Lage und enthielten kein Cu(I). Wildstamm-MccA wurde durch hohe Nitritkonzentrationen gehemmt, wohingegen das Cu(I)-lose MccA_C399A twS keine Substratinhibierung zeigte. Das Eisen-Schwefel-Protein MccC wurde heterolog in Escherichia coli produziert. Da es nur einen Teil der erwarteten [4Fe4S]-Zentren enthielt, wurde es anschließend in vitro rekonstituiert. MccL wurde sowohl in W. succinogenes als auch in E. coli produziert, gereinigt und der Kupfergehalt bestimmt. Durch in vitro-Rekonstitution war das Protein zusätzlich mit Cu(I) beladbar. Schließlich wurden MccA-Homologe und mcc Gencluster in Beta-, Gamma- und Deltaproteobakterien identifiziert und die Diversität der mcc-Gencluster untersucht. Insgesamt wurden die Cytochrom c-Sulfitreduktasen im bisher nicht erreichtem Detail untersucht und die Aufgaben der beteiligten Komponenten beleuchtet.