Erstcharakterisierung des C‐Typ Lektin‐ähnlichen Glykoproteins Clr‐a

• Main Author: Rutkowski, Emilia
• Format: Others
• Language: de
• Published: 2019
• Online Access: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/8753/1/Dissertation_Rutkowski_Emilia_Version%2000.pdf; Rutkowski, Emilia <http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/view/person/Rutkowski=3AEmilia=3A=3A.html> : Erstcharakterisierung des C‐Typ Lektin‐ähnlichen Glykoproteins Clr‐a. Technische Universität, Darmstadt [Ph.D. Thesis], (2019)

In dieser Arbeit wird erstmalig das C‐Typ Lektin‐ähnliche Glykoprotein Clr‐a charakterisiert, welches durch das Gen Clec2e im Natürlichen Killer Genkomplex (NKC) der Maus kodiert wird. Neben Clr‐a sind noch weitere sechs Clr‐Moleküle sowie der Aktivierungsmarker CD69 als Mitglieder der CLEC2 Genfamilie in dieser Region des NKC kodiert, daneben auch die Nkrp1 Immunrezeptoren, denen einige Clr‐Moleküle als Liganden dienen. Die Analyse von diversen Mausgeweben ergab, dass Clec2e selektiv im Gastrointestinaltrakt, und zwar vorwiegend im Dünndarm und im Kolon, transkribiert wird. Die erstmalige Generierung von Clr‐a spezifischen monoklonalen Antikörpern im Rahmen dieser Arbeit ermöglichte sowohl die biochemische Charakterisierung des Clr‐a Glykoproteins als auch die Darstellung dessen darmspezifischer Expression. Ähnlich wie andere Vertreter der CLEC2 Familie, wie z. B. das eng verwandte Clr‐f, ist Clr‐a als Disulfid‐verknüpftes, glykosyliertes Homodimer auf der Zelloberfläche von Transfektanten nachweisbar. Im Gegensatz zu Clr‐f wird jedoch ein Großteil der Clr‐a Moleküle intrazellulär zurückgehalten. Durchflusszytometrische Analysen von Clr‐a/Clr‐f Hybridmolekülen identifizierten Teile der stalk‐Region sowie Teile der cytoplasmatischen Domäne der Clr‐a Glykoproteine als diejenigen Bereiche, die diese intrazelluläre Retention determinieren. Im Darmgewebe konnte mittels qPCR Analysen, Immunoblotting und Immunfluoreszenz eine prominente, homogene und exklusive Expression des Clr‐a Glykoproteins durch intestinale Epithelzellen in Krypten und Villi gezeigt werden. Versuche mit Reporterzellen, die Clr‐a Hybridrezeptoren exprimieren, sowie Bindungsversuche mit Clr‐a Fc-Fusionsproteinen lieferten keinen Nachweis für die Existenz eines Clr‐a Rezeptor. Eine postulierte Bildung von Heterodimeren durch Clr‐a mit dem ebenfalls selektiv im Darmepithel exprimierten Clr‐f wurde durch funktionelle Interaktionsstudien und die Analyse Clr‐f defizienter Mäusen weitgehend ausgeschlossen. Eine mittels Poly(I:C) Injektion künstlich induzierte Darmentzündung führte zu einer schnellen und drastischen Herabregulierung der Clr‐a Proteinexpression. In Versuchen mit knock‐out Mäusen konnte gezeigt werden, dass dieses entzündungsvermittelte Auslöschen der Clr‐a Expression durch den Immunrezeptor TLR3 vermittelt wird. Die Ergebnisse dieser Arbeit beschreiben erstmalig die spezifische Expression des NKC‐kodierten Glykoproteins Clr‐a im Darmepithel der Maus. Die drastische Expressionsmodulation bei einer Darmentzündung deutet wie auch die Zugehörigkeit zur CLEC2 Genfamilie auf eine Funktion von Clr‐a bei der Immunüberwachung des Darms hin.