Entwicklung neuartiger Aldolasevarianten für nicht hydroxylierte Donorsubstrate mittels gelenkter Evolution

• Main Author: Junker, Sebastian, Alexander
• Format: Others
• Language: de
• Published: 2018
• Online Access: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/8313/1/Doktorarbeit%20SJ%2030.08_v3.pdf; Junker, Sebastian, Alexander <http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/view/person/Junker=3ASebastian,_Alexander=3A=3A.html> (2018): Entwicklung neuartiger Aldolasevarianten für nicht hydroxylierte Donorsubstrate mittels gelenkter Evolution.Darmstadt, Technische Universität, [Ph.D. Thesis]

Durch Aldolasen ist es möglich, größere Moleküle mit definiertem Stereozentrum durch C-C-Verknüpfung regio-, und chemoselektiv aufzubauen. Die Fructose-6-phosphat-Aldolase (FSA) zeichnet sich durch ihr sehr breites Akzeptorsubstratspektrum aus; ihr Donorsubstratspektrum ist jedoch auf wenige α-Hydroxyketone limitiert. Um diese Selektivität zu überwinden und FSA-Varianten zu finden, welche nicht hydroxylierte Ketone wie Aceton, oder Aldehyde wie Propionaldehyd und Butyraldehyd als Donorsubstrat akzeptieren, wurde in dieser Arbeit eine smarte FSA-Mutantenbibliothek erstellt (Mutationen an Position D6 und T26). Verschiedene Assay-Methoden zum Screening dieser Bibliothek wurden evaluiert. Die mittels dünnschichtchromatographischem Assay gefundenen 25 FSA-Varianten wurden mittels HPTLC auf ihre Geschwindigkeit und mittels GC auf ihre kompetitive Donorselektivität für Aceton gegenüber Propionaldehyd hin getestet. Es wurden Proteinmodelle zur Erklärung der gefundenen Resultate erstellt. Die Aminosäure an Position 6 entscheidet über die Akzeptanz von hydroxylierten Substraten (D6 ist selektiv für Hydroxyaceton) bzw. von nicht hydroxylierten Substraten (D6A, D6L, D6H und D6E akzeptiert Aceton). Die Aminosäure an Position 26 entscheidet über die Selektivität gegenüber Aceton/Propionaldehyd. FSA D6H ist selektiv für Aceton, FSA D6H/T26L selektiv für Propionaldehyd. Mit ausgewählten FSA-Varianten (FSA D6A/T26I und FSA D6A/T26L) wurden präparative Reaktionen durchgeführt, die Diastereomerenreinheit (>94 % de) und die absolute Stereokonfiguration der so erhaltenen Produkte wurde mittels 2D-NMR und GC-MS bestimmt.