Einfluss von Phosphodiesterase 4 und Proteinphosphatase 1 auf die Regulation proinflammatorischer Cytokine und Stickstoffmonoxid in Lipopolysaccharid-aktivierten Makrophagen
Eine positive Eigenschaft der proinflammatorischen Cytokine IL-1b, TNFa und IL-6 ist die Regulation der Immunabwehr. Diese Substanzen werden u.a. von Makrophagen produziert, die durch den Kontakt mit dem Lipopolysaccharid Gram-negativer Bakterien aktiviert werden. Bei einer dauerhaft verstärkten Pro...
| Summary: | Eine positive Eigenschaft der proinflammatorischen Cytokine IL-1b, TNFa und IL-6 ist die Regulation der Immunabwehr. Diese Substanzen werden u.a. von Makrophagen produziert, die durch den Kontakt mit dem Lipopolysaccharid Gram-negativer Bakterien aktiviert werden. Bei einer dauerhaft verstärkten Produktion dieser inflammatorischen Mediatoren kann es zur Ausbildung von chronischen Entzündungserkrankungen kommen, weshalb es von zentraler Bedeutung ist, die Regulation der Cytokinproduktion zu verstehen, um geeignete Therapeutika zur Behandlung dieser Krankheiten entwickeln zu können. Die Induktion zur Expression des IL-1b-Gens erfolgt in LPS-stimulierten Makrophagen rapide, aber transient. In früheren Untersuchungen der Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass eine negative Regulation von IL-1b erst 8 bis 12 Stunden nach LPS-Stimulierung von murinen Makrophagen einsetzt. Diese Regulation wurde hauptsächlich auf der Ebene der Transkription ausgeübt! . In der vorliegenden Arbeit wurden die Mechanismen dieser Kontrolle in LPS-stimulierten RAW 264.7-Makrophagen näher untersucht. Durch Hinweise in der Literatur wurde vermutet, dass diese Kontrolle womöglich im Protein-Kinase A (PKA)-Weg ausgeübt wird. Da cyclisches Adenosinmonophosphat (cAMP) von großer Bedeutung innerhalb dieses Signalweges ist, wurde zunächst exogenes cAMP als Modulator des PKA-Weges eingesetzt. Die zwischen 8 und 12 Stunden nach LPS-Stimulierung erstmals zu beobachtende negative Regulation von IL-1b konnte durch die Zugabe exogenen cAMPs aufgehoben werden. Die mRNA-Akkumulation und die Produktion von IL-1b wurden hierdurch deutlich verstärkt. Die Bedeutung weiterer für die Produktion von IL-1b möglicherweise wichtiger Regulationsstellen im PKA-Weg wurde durch den Einsatz spezifischer Inhibitoren untersucht. Durch den Einsatz von Rolipram, einem spezifischen Inhibitor der PDE4, die das intrazelluläre cAMP-Lev! el kontrolliert, wurde die LPS-induzierte negative Regulation von IL-1 b ab 12 Stunden aufgehoben. Die IL-1b-mRNA-Akkumulation und -Produktion wurden ebenfalls deutlich verstärkt. Es wurde desweiteren vermutet, dass die Proteinphosphatase 1 (PP1), die den Transkriptionsfaktor CREB dephosphoryliert, eine weitere Kontrolle über die IL-1b-Produktion im PKA-Weg ausüben könnte. Wie bei der Verwendung von Rolipram wurde durch den PP1-Inhibitor Tautomycin die negative Regulation von IL-1b ab 12 Stunden nach LPS-Stimulierung aufgehoben und sowohl die IL-1b-Produktion als auch die mRNA-Akkumulation verstärkt. Die PDE4 und die PP1 scheinen an der negativen Regulation von IL-1b zudem auf der Ebene der Promotor-Aktivität beteiligt zu sein, wie durch Transfektionsversuche mit IL-1b-Promotor-Reportergen-Konstrukten gezeigt werden konnte. Im Verlauf der Arbeit wurde deutlich, dass der Bereich zwischen dem Enhancer und dem minimalen Promotor des IL-1b-Gens womöglich wesentlich für die negative IL-1b-Regulation ist. Da in! der Literatur vielfach auf die Bedeutung des PKA-aktivierbaren Transkriptionsfaktors CREB für die IL-1b-Produktion hingewiesen worden war, sollte eingehender untersucht werden, ob ein Zusammenhang zwischen der Aufhebung der negativen Regulation von IL-1b und dem Aktivierungszustand von CREB besteht. Tatsächlich führten Rolipram und Tautomycin in Reportergen-Assays auch zur verstärkten Aktivierung eines CREB-abhängigen Promotors. Die TNFa-Produktion wurde in anderer Weise durch die eingesetzten Modulatoren verändert. Da Rolipram die LPS-stimulierte Produktion von TNFa vollständig inhibierte, wohingegen Tautomycin die TNFa-Produktion verstärkte, war dies ein zusätzlicher Hinweis darauf, dass die Regulation von IL-1b und TNFa differenziert voneinander erfolgt. Durch den Einsatz von Tautomycin wurden sowohl die IL-1b- als auch die TNFa-Produktion verstärkt, wobei der PP1-Inhibitor jedoch die Produktion von IL-6 und NO vollständig unterdrückte. Die Aktivität der PP1 scheint daher es sentiell für die Produktion von NO und IL-6 zu sein. NO und IL-6 werden zwar erst relativ spät nach LPS-Stimulierung gebildet, doch lassen die vorliegenden Ergebnisse vermuten, dass die PP1 erst ab 12 Stunden nach LPS-Stimulierung in aktivierter Form vorliegt und dies im Zusammenhang mit der negativen Regulation von IL-1b stehen könnte. Die vielfältigen Effekte der PDE4 und der PP1 auf die Regulation und Produktion von IL-1b, TNFa, IL-6 und NO im Rahmen dieser Arbeit dokumentieren deutlich die Komplexität der intrazellulären Signaltransduktionswege nach LPS-Aktivierung. |
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