Kontrolle des prä-mRNA Spleißens durch das Tetrazyklin-Aptamer

• Main Author: Vogel, Marc
• Format: Others
• Language: de
• Published: 2016
• Online Access: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/7005/1/Doktorarbeit%20Marc%20Vogel.pdf; Vogel, Marc <http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/view/person/Vogel=3AMarc=3A=3A.html> (2016): Kontrolle des prä-mRNA Spleißens durch das Tetrazyklin-Aptamer.Darmstadt, Technische Universität, [Ph.D. Thesis]

In dieser Arbeit wurde ein RNA-Schalter entwickelt, welcher das alternative Spleißen eines Kassetten-Exons mithilfe eines Tetrazyklin-bindenden (Tc) Aptamers reguliert. Hierfür wurde entweder die Zugänglichkeit der 3’ Spleißstelle (SS) oder des Verzweigungspunktes (BP) durch das Aptamer reguliert, indem diese Stellen in den P1 Stamm des Aptamers integriert wurden. Durch dieses Design ist die Spleißstelle in Abwesenheit von Tc für das Spleißosom zugänglich, in Anwesenheit von Tc wird sie durch eine stabilisierte Aptamerstruktur blockiert. Zur Kontrolle des Spleißens wurden verschiedene Konstrukte angefertigt, die sich in der Sequenz und Stabilität des P1 Stammes sowie der relativen Lage des Aptamers zur Spleißstelle unterscheiden. Die Ergebnisse zeigen, dass Konstrukte mit einem stabileren Stamm das Spleißen besser regulieren können. Hierbei war zu beobachten, dass eine Stabilisierung des P1 Stammes nahe der Bindetasche den Regulationsfaktor verbessern konnte, eine Stabilisierung am anderen Ende zeigte jedoch keinen Effekt auf die Regulation. Fünf Konstrukte, die eine signifikante Spleißregulation in einem Minigensystem aufwiesen, wurden auf ihre Übertragbarkeit im Kontext einer vollständigen mRNA (Luziferase-Reportergen, Kontrolle des humanen Transkriptionsfaktors MAX und Kontrolle des B-Zell-Rezeptors CD20) getestet. Für alle Konstrukte konnte gezeigt werden, dass sie in den drei Genen erfolgreich das Spleißen regulieren. Hierzu wurde das Aptamer komplett mit dem Kassetten-Exon und Teile der beiden flankierenden Introns übertragen. Bei der Insertionsstelle wurde darauf geachtet, dass es sich um eine natürliche Intronposition handelt. War eine solche nicht vorhanden, wurde eine Sequenz gesucht, die Ähnlichkeiten zu den Insertionsstellen in bereits erfolgreich angewandten Systemen hatte. Diese Ergebnisse zeigen, dass ein Kontext-unabhängiges aptamer-kontrolliertes Exon entwickelt werden konnte, mit dem die Kontrolle jedes beliebigen Gens möglich sein sollte. Das Exon zeigt eine dosisabhängige, zelltypunabhängige Regulation, die außerdem unabhängig von der Expressions-stärke des jeweiligen Gens ist. Basierend auf der konditionalen Expression des Rezeptors CD20 durch das aptamer-kontrollierte Exon konnte ein Suizidgen aufgebaut werden, das es ermöglicht, Zellen gezielt abzutöten. Durch Tc kommt es zu einer erhöhten Expression von CD20, wodurch die Zellen in Gegenwart von Rituximab absterben. Die Anwendung eines solchen Systems könnte im Bereich der Krebstherapie oder als Sicherheitsschalter in der Gentherapie liegen.