Schwefel-Mobilisierung bei Acidianus ambivalens

• Main Author: Lauber, Karin
• Format: Others
• Language: German; de
• Published: 2006
• Online Access: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/689/1/Dissertation.pdf; Lauber, Karin <http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/view/person/Lauber=3AKarin=3A=3A.html> : Schwefel-Mobilisierung bei Acidianus ambivalens. [Online-Edition] Technische Universität, Darmstadt [Ph.D. Thesis], (2006)

Acidianus ambivalens ist ein hyperthermophiles Crenarchaeon der Ordnung Sulfolobales, welches aerob Schwefel oxidieren kann. Da das Schwefel-oxidierende Enzym im Cytoplasma lokalisiert ist, muss der Schwefel ausserhalb der Zelle aktiviert und fuer die im Cytoplasma stattfindenden Reaktionen in die Zelle transportiert werden. Die Schwefelmobilisierung wurde in dieser Arbeit naeher analysiert. Zunaechst wurde das Wachstum mit alternativen Substraten, Tetrathionat und Thiosulfat, untersucht, die ein wichtiges Zwischenprodukt der Schwefelmobilisierung darstellen koennten. Die Zellen wuchsen nicht mit Thiosulfat wohl aber mit Tetrathionat. Hohe Konzentrationen an Trithionat wurden beim Wachstum mit Tetrathionat gebildet, nicht aber beim Wachstum mit Schwefel. Weiterhin bildeten die Zellen signifikante Mengen an Schwefel, der hydrophiler als elementarer Schwefel war. Tetrathionat wurde von Kulturen bei Wachstum mit Mischsubstraten bevorzugt abgebaut und Tetrathionat-adaptierte Zellen wuchsen nur schlecht mit Schwefel. Tetrathionat kam somit nicht als Intermediat des aeroben Schwefelstoffwechsels in Frage. In Kulturueberstaenden und Schwefelsediment nach Kulturwachstum wurde nach sekretierten Proteine gesucht. Spezifisch nur im Schwefelsediment nach aeroben Wachstum mit Schwefel wurde ein Protein gefunden, welches Schwefel-Binde-Protein (SBP) genannt wurde. Das SBP war stark glykosyliert und hatte eine braeunliche Faerbung in Loesung, welche mit einer hohen Eisenkonzentration einerging. Der Edmann-Abbau ergab eine Mischsequenz, welche mit einem Serin startet. Sie zeigte eine Uebereinstimmung mit einem Fragment, genannt contig 275 der internen partiellen Genomsequenz-Datenbank von Acidianus ambivalens. Die abgeleitete Aminosaeuresequenz war 310 Aminosaeuren lang (? 34,1 kDa) und zeigte mehrere vorhergesagte Glykosylierungsstellen. Vier Methion-Codons in Abstaenden von 4, 8, 30 und 41 Aminosaeuren wurden stromauf des sbp-Gens identifiziert. Eine Primerextensions-Analyse zeigte, dass der Transkriptionsstartpunkt 9 nt vor dem zweiten Methionin lag. Vor dem Transkriptionsstart lagen im archaea-typischen Abstand eine TATA-Box und ein BRE. Die 30 Aminosaeuren stromauf vom Protein hatten die typischen Zusammensetzung eines sekretorischen Signalpeptids, mit N-Domaene mit zwei Lysinen als Sequenzmotiv und einer hydrophoben H-Domaene vorhergesagter alpha-Helix. Es wurde versucht die sbp-Region in E. coli ueberzuexprimieren und das Protein mittels Saeulenchromatographie aufzureinigen aber mit negativen Resultaten. Auch Western-Analysen gaben keine Ergebnisse. Eine Southern-Hybridisierung des Genoms von Acidianus ambivalens ergab drei unabhaengige Banden, was eine dreifache Kopienzahl des sbp im Genom vermuten laesst. Northern-Hybridisierungen ergaben, dass die sbp-RNA während der kompletten Wachstumsphase der Zellen beim aeroben Schwefelstoffwechsel gebildet wird. Die RNA war viermal laenger als erwartet. Dies deutet darauf hin, dass das sbp in einem Operon mit mehreren Gene noch nicht identifizierten Genen liegt.