Isolierung symbiosespezifischer Gene aus Geosiphon pyriformis und funktionelle Charakterisierung des ersten Glomeromycota-Zuckertransporters

• Main Author: Martin, Holger
• Format: Others
• Language: German; de
• Published: 2006
• Online Access: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/669/1/hmartin_korrektur.pdf; Martin, Holger <http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/view/person/Martin=3AHolger=3A=3A.html> (2006): Isolierung symbiosespezifischer Gene aus Geosiphon pyriformis und funktionelle Charakterisierung des ersten Glomeromycota-Zuckertransporters.Darmstadt, Technische Universität, [Online-Edition: http://elib.tu-darmstadt.de/diss/000669 <http://elib.tu-darmstadt.de/diss/000669> <official_url>],[Ph.D. Thesis]

Die vorliegende Arbeit befasst sich auf molekularer Ebene mit Geosiphon, einer bislang einzigartigen Endosymbiose zwischen einem Pilz (Geosiphon pyriformis) und dem Cyanobakterium Nostoc punctiforme. Das symbiontische Konsortium hat viele Ähnlichkeiten mit der arbuskulären Mykorrhiza und kann in mancher Hinsicht als Modell für diese dienen. In dieser Arbeit wurde ein Zuckertransporter, der möglicherweise am Nährstoffaustausch zwischen den Symbionten beteiligt ist, isoliert und teilweise charakterisiert. Zu Beginn wurde eine verlässliche Methode zur Isolation von mRNA aus geringen Mengen an Geosiphon-Blasen entwickelt. Dabei wurde ein mRNA-Gehalt von ca. 0,2 ng pro Blase ermittelt. Weiter wurde ein Verfahren zur cDNA-Synthese etabliert. Klonierte cDNA-Sequenzen wurden sequenziert und zeigten eine sehr gute Qualität; z.B. zeigte keine der Sequenzen Homologien zu Nostoc-Genen. Pilzliche und bakterielle mRNA können somit durch die etablierten Methoden sehr effektiv getrennt werden. Aufbauend auf den genannten Methoden wurde eine subtraktive cDNA-Bank hergestellt. Die verwendete cDNA wurde aus 72 h im Licht bzw. im Dunkeln inkubierten Geosiphon-Blasen gewonnen. 282 Klone der subtraktiven Bank wurden durch differentielles Screening nach Genen durchsucht, deren Expression lichtreguliert ist. Fünf solcher cDNA-Sequenzen wurden identifiziert; vier davon (hm24-E11, hm24-H4, hm26-H3 und hm27-F2) zeigten schwache Ähnlichkeiten zu Transportproteinen bzw. Komponenten von Transportsystemen. Die Sequenz hm26-H3 hatte schwache Ähnlichkeit zu einem Zuckertransporter eines Basidiomyceten. Die differentielle Expression dieser Gene im Licht, bzw. im Dunkeln, konnte durch unabhängige, semiquantitative RT-PCR Kontrollexperimente jedoch nicht bestätigt werden. Im weiteren Verlauf der Arbeit wurde aus Geosiphon pyriformis cDNA eine größenfraktionierte Hefeexpressions-cDNA-Bank mit 6*105 E. coli-Klonen hergestellt. Durch funktionelle Komplementation der Hefemutante EBY VW4000 mit Plasmiden dieser Bank wurde eine 1845 bp lange cDNA-Sequenz des Zuckertransportergens Gphxt1 charakterisiert. Diese zeigte auf Aminosäureebene ca. 40 % Ähnlichkeit zu anderen Zuckertransportern. Aus der cDNA-Sequenz wurden drei offene Leserahmen (ORF) mit einer Länge von 432, 480, und 496 Aminosäuren (AS) abgeleitet. In den ORFs wurden konservierte Bereiche, sowie 11 bzw.12 Transmembran-Helices identifiziert. Anhand dieser Ergebnisse wurde GpHXT1p in die major facilitator superfamily (MFS) eingeordnet. Die cDNA-Sequenz des ORF mit 496 AS Länge beginnt ohne Startkodon, was darauf hinweist, dass die cDNA möglicherweise trunkiert ist. Die vermutete Vollängen-mRNA von Gphxt1 könnte somit für mehrere funktionelle Zuckertransporter kodieren. Wachstumstests mit heterolog exprimierenden Hefen ergaben, dass GpHXT1p das Wachstum der komplementierten Hefe in folgender Intensität ermöglicht: Bei Substratkonzentrationen >50 mM D-Mannose>D-Glukose>D-Fruktose>>D-Galaktose. Bei Substratkonzentrationen D-Glukose>>D-Galaktose>D-Fruktose. Untersuchungen zum Transportmechanismus von GpHXT1p an heterolog exprimierenden Hefen bzw. Oozyten von Xenopus laevis zeigten, dass der Substrattransport im Symport mit Protonen erfolgt. Aufnahmemessungen mit 14C-Glukose und der komplementierten Hefe ergaben folgende Werte für die Transportkinetik von GpHXT1p: KM = ca. 60 mM Glukose; Vmax = ca. 0,15 nmol Glukose*10-5 Zellen*min-1. GpHXT1p kann somit als „low-affinity“-Transporter klassifiziert werden. Durch ein RT-PCR-Experiment konnte gezeigt werden, dass eine Inkubation von Geosiphon-Blasen von ≥ 72 h im Dunkeln eventuell eine Verringerung der Expression von Gphxt1 im Vergleich zu belichteten Proben bewirkt. Gphxt1 könnte ein Schlüsselgen für die Funktion der Geosiphon-Symbiose darstellen. Die Ergebnisse werden im Zusammenhang mit ihrer möglichen Bedeutung für die Aufklärung des Stofftransportes zwischen den Symbiospartnern von Geosiphon und für die Weiterentwicklung der Erforschung von Geosiphon auf genomischer Ebene diskutiert. Die Kenntnis der cDNA-Sequenz von Gphxt1 wird wahrscheinlich zur Isolierung von Zuckertransporter-Genen aus anderen AM-Pilzen führen. Mit Hilfe der erstellten Hefeexpressions-cDNA-Bank können in Zukunft weitere Gene aus Geosiphon pyriformis isoliert und funktionell charakterisiert werden.