Erschließung einer natürlichen Peptid-Protein-Wechselwirkung als molekulare Grundstruktur zur hochaffinen Kopplung von Proteinen und Entwicklung biotechnologischer Anwendungsmodule

• Main Author: Schirmer, Matthias
• Format: Others
• Language: de
• Published: 2017
• Online Access: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/5934/2/Dissertation_Matthias%20Schirmer.pdf; Schirmer, Matthias <http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/view/person/Schirmer=3AMatthias=3A=3A.html> : Erschließung einer natürlichen Peptid-Protein-Wechselwirkung als molekulare Grundstruktur zur hochaffinen Kopplung von Proteinen und Entwicklung biotechnologischer Anwendungsmodule. Technische Universität, Darmstadt [Ph.D. Thesis], (2017)

Die Steuerung fast aller Vorgänge in biologischen Organismen beruht auf Molekülerkennung. Der weit überwiegende Teil diagnostischer und pharmazeutischer Lösungen basiert auf spezifischen molekularen Wechselwirkungen. Protein-Protein-Interaktionen spielen dabei eine wesentliche Rolle. Um daraus einen Nutzen zu ziehen kommt es darauf an, sich der ausprägenden Strukturmotive der Wechselwirkung innerhalb einer Aminosäuresequenzen in geeigneter Weise zu bedienen. Die in den letzten Jahrzehnten etablierten molekularbiologischen Methoden ermöglichen es, derartige Erkennungsmuster für verschiedene biotechnologische Konzepte nutzbar zu machen. So können Proteine, die Gegenstand aktueller biologischer oder biomedizinischer Forschung sind, mit Sequenzbereichen eines interagierenden Proteins fusioniert werden. Mit Hilfe ihres komplementären Interaktionspartners ist es möglich sie zu identifizieren und aus komplexen Stoffgemischen zu isolieren oder ihre Stoffwechselwege zu verfolgen und somit biologische Prozesse zu charakterisieren. Im Idealfall verleihen diese Anhängsel oder Tags dem Fusionsprotein zusätzlich bestimmte Eigenschaften und sind flexibel in verschiedenen Methoden einsetzbar. Die vorliegende Arbeit bedient sich zweier Komponenten des bakteriellen Typ IV Sekretionssystems, ein Konjugationsapparat dessen Proteinkomplex die bakterielle Membran durchspannt und biologische Makromoleküle transportiert. Das TraO-Protein dieses Komplexes weist eine ausgesprochen starke Interaktion gegenüber dem TraN-Peptid auf, wodurch TraO in der äußeren Membran der Zelle verankert wird. Die Interaktionspartner wurden für unterschiedliche Applikationen optimiert und die Wechselwirkungen verschiedener Derivate charakterisiert. Seitens TraO wurden Sequenzmodifikationen zur Verbesserung der biochemischen Eigenschaften vorgenommen. Bei TraN erfolgten eine sukzessive Verkürzung sowie punktuelle Austausche innerhalb der Aminosäuresequenz, um das für die Bindung benötigte Minimalmotiv zu identifizieren und die Sequenz für verschiedene Anwendungen nutzbar zu machen. Letztendlich konnten mehrere Varianten des TraO/TraN-Systems identifiziert werden, die sich zur weiteren Entwicklung biotechnologischer oder biochemischer Applikationen anbieten. Das entwickelte System konnte erfolgreich in der affinitätschromatographischen Reinigung von biologisch aktiven Zytokinen eingesetzt werden und ist im Western Blot detektierbar. Mit TraN markierte Proteine konnten auf eukaryontischen Zellen exprimiert und nachgewiesen werden. Die zielgerichtete Fluoreszenzmarkierung von Rezeptorproteinen mit Hilfe des TraO/TraN-Systems machte es darüber hinaus möglich, geeignete Sonden herzustellen um Zytokin-Rezeptorinteraktionen auf Oberflächen nachzuweisen. Durch weitere Modifikationen der Bindungspartner konnte eine kovalente Bindung zwischen Protein und Peptid hergestellt werden. Für die unterschiedlichen Applikationen konnten diverse Varianten des Tag-System etabliert werden. Die beschriebenen Ergebnisse zeigen das große Potenzial des TraO/TraN-Systems für die biotechnologische Verwendung auf.