Molekulare Wirkmechanismen rekombinant hergestellter Chemokinrezeptor-Antagonisten auf entzündungsrelevante Immunzellen
Im Rahmen dieser Arbeit wurde der nephritogene T-Helfer-1-Zellklon, IF12, hinsichtlich seines Chemokinrezeptorprofils auf RNA- und Proteinebene charakterisiert, um ein definiertes Zellmodell zu besitzen, welches für die anschließende Austestung von drei Chemokinrezeptor-Antagonisten geeignet ist. Da...
| Summary: | Im Rahmen dieser Arbeit wurde der nephritogene T-Helfer-1-Zellklon, IF12, hinsichtlich seines Chemokinrezeptorprofils auf RNA- und Proteinebene charakterisiert, um ein definiertes Zellmodell zu besitzen, welches für die anschließende Austestung von drei Chemokinrezeptor-Antagonisten geeignet ist. Dazu wurde die RNA von Mitogen-aktivierten und unstimulierten Th1-Zellen gewonnen und das Chemokinrezeptorprofil mittels RT-PCR und cDNA-Array untersucht. Das Ergebnis dieser Experimente zeigte eine konstitutive Expression der Rezeptoren CCR1, CCR2, CCR5-7, CXCR3, CXCR4 auf RNA-Ebene. Durch die Aktivierung der Th1 Zellen mit ConA wurde eine signifikant gesteigerte Expression von den Rezeptoren CCR4, CCR6 und CCR7 und eine deutliche Reduktion der Expression von CCR5 und CXCR3 induziert. Auf Proteinebene konnte die Oberflächenexpression der für die Antagonistenstudien wichtigen Chemokinrezeptoren CCR2, CCR5 und CXCR3 nachgewiesen werden. Hinsichtlich der gängigen Definition von T-Zell-Subtypen konnte der Th1IF12-Zellklon als central memory oder Gedächtnis-Zelltyp eingestuft werden (Sallusto et al., 1998). Dieser Zellklon wurde für die weiteren experimentellen Versuche verwendet. Weiterhin wurden drei Chemokinrezeptor-Antagonisten, eine N-terminal deletierte Form des Chemokins MCP-1/CCL2, MCP-1(1-8)del, virales MIP-II und eine N-terminal deletierte Variante des Chemokins I-TAC/CXCL11, I-TAC(1-3)del, in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris exprimiert, durch Heparin-Affinitätschromatographie aufgereinigt und deren inhibitorische Wirkung auf die Th1-Zellen untersucht. Durch die Expression in Pichia pastoris konnten drei funktionell bioaktive Chemokinrezeptor-Antagonisten generiert wurden, die in der Lage waren, die spezifische Liganden-induzierte Th1-Chemotaxis Rezeptor-spezifisch zu inhibieren. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Kombination von zwei Chemokinen (MCP-1/CCL2 und IP-10/CXCL10 oder I-TAC/CXCL11) die Th1-Migration signifikant steigerte und, dass eine deutliche Inhibition dieser gesteigerten Chemotaxis durch simultanen Einsatz von MCP-1(1-8)del und I-TAC(1-3)del erzielt wurde. Bei der Untersuchung zur Signalweiterleitung von CXCR3 wurde beobachtet, dass weder Pertussis-Toxin (PTX) noch AG490 einen Einfluss auf die I-TAC-induzierte Internalisierung hatte. Die I-TAC-vermittelte Chemotaxis konnte, wie erwartet durch PTX blockiert werden, wodurch die Signalvermittlung über Gi bestätigt wurde. AG490 führte überraschenderweise zu einer Steigerung der I-TAC-induzierten Chemotaxis. Die Effekte von PTX und AG490 wurden anschließend auf die I-TAC-induzierte Kalzium-Mobilisierung getestet und ergaben eine Blockierung des Kalziumsignals nach PTX-Behandlung, sowie ein verlängertes Kalziumsignal nach AG490-Behandlung. Beim Einsatz des Chemokinrezeptor-Antagonisten I-TAC(1-3)del im in vivo-Modell zur Untersuchung der Leukozytenwanderung im Mausohr (Intravitalmikroskopie, IVM) konnte beobachtet werden, dass ein durch IP-10/CXCL10-Stimulierung gesteigertes Rollverhalten der Th1-Zellen am Venenendothel durch anschließende Antagonisten-Behandlung signifikant inhibiert wurde. Zusammenfassend zeigt dies, dass die Expression der drei rekombinanten Chemokinrezeptor-Antagonisten, MCP-1(1-8)del, vMIP-II und I-TAC(1-3)del, in Pichia pastoris zu potenten und funktionell bioaktiven Proteinen führte, die ein viel versprechendes Werkzeug für die Behandlung Th1-vermittelter Entzündungskrankheiten darstellen. |
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