Alternatives Spleißen unter Hypoxie in humanen Endothelzellen

• Main Author: Kemmerer, Katrin
• Format: Others
• Language: de
• Published: 2017
• Online Access: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/5553/1/PhD%20Kemmerer%20nach%20Disputation.pdf; Kemmerer, Katrin <http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/view/person/Kemmerer=3AKatrin=3A=3A.html> (2017): Alternatives Spleißen unter Hypoxie in humanen Endothelzellen.Darmstadt, Technische Universität, [Ph.D. Thesis]

Hypoxie spielt eine bedeutende Rolle in vielen pathologischen Prozessen wie bei vaskulären Erkrankungen oder auch Tumoren. Während die transkriptionelle Anpassung schon intensiv untersucht wurde, wurde der posttranskriptionellen Regulation bisher wenig Beachtung geschenkt. Insbesondere das alternative Spleißen eröffnet eine Möglichkeit der schnellen und sehr spezifischen Anpassung an sich ändernde Umgebungen. In dieser Arbeit wurden deshalb zwei Gene untersucht, die beide unter Hypoxie in Endothelzellen alternativ gespleißt werden. Das erste der beiden Gene ist der MYC assoziierte Faktor X (MAX), ein ubiquitär exprimierter Transkriptionsfaktor in einem Netzwerk, das die Proliferation und Zelldifferenzierung reguliert. MAX wurde als eines von neun alternativ gespleißten Genen in einem Exon Array identifiziert. Während Hypoxie die Expression anderer Mitglieder des Netzwerkes ändert, wurden bisher keine Änderungen in der MAX Expression gefunden. In Endothelzellen werden zwei MAX mRNA Isoformen induziert, die sich an ihrem 3’ Ende vom Wildtyp unterscheiden. Isoform C wird durch den NMD (nonsense-mediated mRNA decay) abgebaut, während Isoform E für ein instabiles Protein mit einem veränderten C-Terminus kodiert. Diese Destabilisierung wird durch die Isoform E spezifische 36 aa lange Sequenz vermittelt, die auch in der Lage ist, heterologe Proteine durch Fusionieren an deren C-Terminus zu destabilisieren. Beide Spleißereignisse sind demnach unproduktiv und scheinen vielmehr der Reduktion des Wildtyps unter Hypoxie zu dienen. Durch neuere Studien wurde gezeigt, dass deregulierte Spleißfaktoren zum Fortschreiten von Tumoren beitragen können. Um die Regulation solcher Proteine besser zu verstehen, wurde im zweiten Teil dieser Arbeit das alternative Spleißen des RNA bindenden Proteins hnRNP DL charakterisiert. Unter Hypoxie wird eine unproduktive mRNA Isoform durch Inklusion eines Exons im 3’ UTR induziert, die durch Abbau im NMD zu einer geringeren Proteinmenge in Endothelzellen führt. Eine reduzierte Menge von hnRNP DL konnte mit einer reduzierten Proliferation in Endothelzellen assoziiert werden. HnRNP DL ist in der Lage, das Spleißen der eigenen prä-mRNA zugunsten der NMD sensitiven Isoform zu verschieben. Diese Autoregulation ist mit einem ultrakonservierten Element verbunden und wurde bereits für mehrere Mitglieder der hnRNP Familie beschrieben. Durch Minigen-Analysen konnte die Bindesequenz von hnRNP DL auf 50 nt auf- oder abwärts des alternativen Exons eingegrenzt werden. Außerdem konnte eine gegenseitige Regulation der paralogen Proteine hnRNP D und DL in HeLa-Zellen bestätigt werden. Die Proteine regulieren somit die eigene sowie die gegenseitige Expression durch einen negativen feedback loop. Diese Art der Crossregulation ist auch für andere paraloge hnRNPs beschrieben worden, jedoch anders als hier gezeigt, keine Regulation in beide Richtungen.