In vitro und in vivo Studien zeigen konservierte Eigenschaften des RNAi-Mechanismus’ in Trypanosoma brucei
RNA interference (RNAi) ist ein posttranskriptioneller gene silencing Mechanismus, der in Protozoen, Pilzen, Pflanzen und Tieren nachgewiesen werden konnte. Der Auslöser ist doppelsträngige RNA (dsRNA), die zur sequenzspezifischen Degradation homologer mRNA-Moleküle führt. Im RNAi Initiationsschritt...
| Summary: | RNA interference (RNAi) ist ein posttranskriptioneller gene silencing Mechanismus, der in Protozoen, Pilzen, Pflanzen und Tieren nachgewiesen werden konnte. Der Auslöser ist doppelsträngige RNA (dsRNA), die zur sequenzspezifischen Degradation homologer mRNA-Moleküle führt. Im RNAi Initiationsschritt wird zunächst dsRNA durch die Ribonuklease Dicer in so genannte short interfering RNAs (siRNAs) prozessiert. Diese weisen eine Länge von 21 – 26 Nukleotiden auf. Zusätzliche Proteine assoziieren danach mit je einem siRNA-Molekül und bilden den RNA induced silencing complex (RISC). Im anschließenden Effektorschritt kommt es dann zur Erkennung und Degradation der Ziel-mRNA. Dabei erfolgt die Erkennung durch die Ausbildung komplementärer Basenpaarungen zwischen der siRNA und dem Zielmolekül. Die abschließende Degradation der mRNA wird durch eine endonukleolytische Aktivität des RISCs katalysiert. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der biochemischen Charakterisierung des RNAi-Mechanismus’ in dem humanpathogenen Parasiten Trypanosoma brucei. Es wurden zwei in vitro Assays etabliert, die sowohl den Initiations- als auch den Effektorschritt der RNAi-Reaktion rekapitulieren. Darüber hinaus wurde ein in vivo Assay entwickelt, der die Identifizierung neuer RNAi-Komponenten ermöglicht. Folgende Ergebnisse wurden erzielt: 1) Die biochemische Charakterisierung des RNAi-Initiationsschrittes in Trypanosoma brucei ist konsistent mit der Beteiligung von Domänen, die von Dicer-Orthologen anderer Spezies bekannt sind. So impliziert die terminale Prozessierung der dsRNA die Beteiligung einer PAZ-Domäne. Die Abhängigkeit dieser Reaktion von hydrolysierbaren Adenosinphosphaten ist konsistent mit einer Helikaseaktivität. Darüber hinaus weisen die strukturellen Charakteristika der Reaktionsprodukte sowie die Abhängigkeit der dsRNA-Prozessierung von Magnesiumionen auf die Beteiligung einer RibonukleaseIII-Domäne hin. 2) Strukturelle Analysen der siRNAs aus T. brucei zeigen Eigenschaften, die von siRNAs aus anderen Systemen bekannt sind. Die in vitro Charakterisierung des Effektorschrittes weist auf eine RISC-typische Reaktion hin, in der siRNAs die Position der mRNA-Hydrolyse spezifizieren. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die Transfektion synthetischer siRNAs knockdown-Phänotypen in T. brucei auslösen können. Dabei weisen funktionelle siRNAs eine vergleichsweise höhere thermodynamische Stabilität am 5’-Ende als am 3’ Ende des sense-Stranges auf. 3) Es wurde das so genannte „RNAi in vivo System“ etabliert, das die Identifizierung von RNAi-Komponenten in T. brucei ermöglicht. Dabei können individuelle Gene mit Hilfe einer transgenen Zelllinie getestet werden. Der Nachweis von RNAi-Komponenten erfolgt über die heterologe Expression eines Reportergens, das ein fluoreszierendes Protein codiert. Der in vivo Assay wurde mit der RNAi-Komponente TbAGO1 und α-Tubulin als unabhängige Kontrolle getestet. Die Quantifizierung der Fluoreszenz ergab dabei erwartungsgemäß 10-fach höhere Werte für TbAGO1 als für die Negativkontrolle. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass der RNAi-Mechanismus in T. brucei konservierte Eigenschaften aufweist. Die etablierten in vitro und in vivo Systeme ermöglichen die Identifizierung und die biochemische Charakterisierung neuer RNAi-Komponenten in T. brucei. Als Perspektive kann die Transfektion synthetischer siRNAs dazu genutzt werden, ein genomweites screening nach potentiellen Wirkstoffzielen im Parasiten durchzuführen. |
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