Struktur und Funktion enzymatisch vernetzbarer Proteaseinhibitoren von Streptomyces mobaraensis

• Main Author: Zindel, Stephan
• Format: Others
• Language: German; de
• Published: 2013
• Online Access: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/3467/1/Dissertation%20-%20Stephan%20Zindel.pdf; Zindel, Stephan <http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/view/person/Zindel=3AStephan=3A=3A.html> (2013): Struktur und Funktion enzymatisch vernetzbarer Proteaseinhibitoren von Streptomyces mobaraensis.Darmstadt, Technische Universität, [Ph.D. Thesis]

Streptomyceten sind immobile Bodenbakterien mit einem Pilzmyzel-ähnlichen Wachstum. Um ihren Lebensraum und sich selbst gegen Fressfeinde zu verteidigen, produzieren sie eine Vielzahl bioaktiver Sekundärmetabolite. S. mobaraensis produziert u.A. drei proteinöse Inhibitoren gegen Proteasen unterschiedlicher Familien, die gleichzeitig Substrate einer intrinsischen Transglutaminase (TGase) sind. Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung der codierenden Gene sowie eine weitergehende Charakterisierung der Proteine. Das Gen des Streptomyces-Papaininhibitors SPI wurde über molekularbiologische Methoden vollständig identifiziert. Auch gelang die heterologe Produktion in E. coli, jedoch blieb rSPI trotz unterschiedlicher Herstellungsverfahren inaktiv. Durch spätere Experimente stellte sich heraus, dass wtSPI aus einem Protein mit Bindestellen für Transglutaminase und einem Kofaktor besteht, und jener Kofaktor die eigentliche inhibierende Komponente ist. Die codierenden Gene des Streptomyces-Subtilisin- und TAMEP-Inhibitors SSTI sowie des Dispaseautolye-induzierenden Proteins DAIP wurden zusammen mit den Rodlinen, Chaplinen, der TGase-aktivierenden Metalloprotease TAMEP, sowie zwei TAMEP-verwandten Metalloproteasen, fünf Klasse 1- und einer Klasse 2-Signalpeptidase über vollständige Genom-sequenzierung und anschließenden Datenbankabgleich identifiziert. Die weitere biochemische Charakterisierung von DAIP zeigte nachweislich, dass es sich hierbei um ein Enzym handeln muss, jedoch konnte der Wirkmechanismus nicht bestimmt werden. In silico-Analysen der Proteinstruktur wiesen auf eine Aspartylprotease hin. Die bereits früher vorgenommene Einordnung von SSTI in die Familie der Streptomyces-Subtilisininhibitoren wurde durch die vollständige Proteinsequenz bestätigt. In silico-Analysen der Proteinstruktur weisen darauf hin, dass die für TGase putativ zugänglichen Aminosäuren und die Subtilisinbindestelle auf gegenüber liegenden Proteinhälften liegen.