Expression und Analyse plasmodialer und antiplasmodialer Proteine in Pflanzen

• Main Author: Reichwein, Simone
• Format: Others
• Language: German; German; de
• Published: 2013
• Online Access: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/3397/1/Dissertation%20Simone%20Reichwein-01.05.13-online%20version.pdf; http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/3397/7/Dissertation%20Simone%20Reichwein%20-%208.%20Anhang.zip; Reichwein, Simone <http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/view/person/Reichwein=3ASimone=3A=3A.html> : Expression und Analyse plasmodialer und antiplasmodialer Proteine in Pflanzen. Technische Universität, Darmstadt [Ph.D. Thesis], (2013)

Auf der Suche nach neuen Möglichkeiten im Kampf gegen die Malaria werden auch innovative Ideen und neue, ungewöhnliche Strategien diskutiert und verfolgt, die angesichts zahlreicher Rückschläge bei der Anwendung etablierter Maßnahmen zunehmend an Bedeutung gewinnen. Der vorliegenden Arbeit liegt die Idee zugrunde, durch die Applikation inhibitorischer Proteine mittels transgener Pflanzen die Entwicklung des Parasiten im Vektor Anopheles zu hemmen und in der Folge die Malaria-Transmission zu reduzieren. Da auch weibliche Anopheles-Moskitos Pflanzensäfte als Zuckerquelle nutzen (Foster, 1995), sollte die Aufnahme der antiplasmodial wirksamen Proteine durch transgene Pflanzen erfolgen, welche die entsprechenden Proteine in ihrem Nektar akkumulieren. Die aufgenommenen Proteine sollten entweder mit Strukturen des Mitteldarms bzw. der Speicheldrüse von Anopheles oder den entsprechenden Entwicklungsstadien von Plasmodium interagieren, um in der Folge die Transmission des Parasiten auf den Menschen zu reduzieren. Ziele dieser Arbeit waren daher die Produktion entsprechender Kandidatenproteine, die Evaluation ihrer antiplasmodialen Wirksamkeit in Fütterungsexperimenten mit Anopheles sowie die Etablierung von Ricinus communis als pflanzliches Applikationssystem der antiplasmodialen Proteine. In den vergangenen Jahren konnten verschiedene Proteine identifiziert werden, die durch eine Interaktion mit den Sexualstadien von Plasmodium die Entwicklung des Parasiten inhibieren und so eine Übertragung reduzieren können. Nachdem für das synthetische Dodecapeptid salivary gland and midgut peptide 1 (SM1-Peptid; Ghosh et al., 2001) in transgenen Moskitos eine Inhibition der Entwicklung von Plasmodium gezeigt werden konnte (Ito et al., 2002), stellte sich in der vorliegenden Arbeit die Frage, ob diese Wirkung auch nach einer oralen Aufnahme dieses Peptids bzw. weiterer Kandidatenproteine durch Anopheles nachgewiesen werden kann. Um die antiplasmodiale Wirksamkeit in Fütterungsexperimenten mit Anopheles untersuchen zu können, wurden daher verschiedene Varianten des SM1-Peptids sowie der antiplasmodial wirksamen Peptide PcFK1 und PcFK2 aus dem Toxin von Psalmopoeus cambridgei (Choi et al., 2004) im bakteriellen und transienten pflanzlichen Expressionssystem produziert und charakterisiert. Dabei konnte durch den positiven Nachweis der trypsininhibitorischen Aktivität des zur Erhöhung der Stabilität als Grundgerüst verwendeten Cystin-Knoten-Mikroproteins MCoTI-II die korrekte Faltung der in den beiden verschiedenen Expressionssystemen produzierten Proteine gezeigt werden. Darüber hinaus konnte in der vorliegenden Arbeit am Beispiel des CKM MCoTI-II aus Momordica cochinchinensis zum ersten Mal die rekombinante Produktion eines funktionellen Cystin-Knoten-Mikroproteins in Pflanzen beschrieben werden. Weiterhin konnten als plasmodiale Antigene die A-Domäne des thrombospondin-related anonymous protein (TRAP) der Sporozoiten von P. berghei, die Ookineten-Oberflächenproteine P25 und P28 von P. falciparum sowie das Speicheldrüsenprotein Saglin von Anopheles als Zielstruktur des Vektors im bakteriellen Expressionssystem produziert werden. Die Proteine konnten daher zur Gewinnung antiplasmodialer Antikörperfragmente verwendet werden, die in zukünftigen Arbeiten ihrerseits als transmissionsblockierende Proteine angewandt werden können. Als Applikationssystem für antiplasmodiale Proteine erscheint in diesem Zusammenhang der in tropischen und subtropischen Ländern weit verbreitete Ricinus communis mit seinen extra-floralen Nektarien geeignet, wenn diese im Phloemsaft bzw. im Nektar akkumuliert werden. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass phloemspezifische Proteine auch in den Nektar der Pflanze sezerniert werden. Daher wurde die stabile Expression der inhibitorischen Peptide unter Verwendung des phloemspezifischen SUC2-Promotors aus A. thaliana (AtSUC2) in R. communis versucht. Da Ricinus jedoch nur äußerst schwer zu transformieren und regenerieren ist, konnte ein Nachweis der inhibitorischen Kandidatenproteine im Nektar im gegebenen Zeitrahmen aber nicht erreicht werden. Die Untersuchung der antiplasmodialen Wirksamkeit der Kandidatenproteine auf P. berghei erfolgte in Fütterungsversuchen mit infizierten A. stephensi, wobei jedoch keine signifikante inhibitorische Wirksamkeit der in diesem Rahmen getesteten Proteinvarianten beobachtet werden konnte. Da diese Ergebnisse jedoch als erste Tests dieses Ansatzes zu verstehen sind, sollten sich hier weitere Untersuchungen anschließen. Zusammenfassend konnte diese Arbeit die Grundlagen für die Entwicklung eines alternativen Ansatzes legen, der letztendlich zusammen mit anderen, bereits etablierten Strategien und Maßnahmen, wie z. B. dem Einsatz von Insektiziden und insektizid-beschichteten Bettnetzen oder der Behandlung mit Malaria-Therapeutika, zur Senkung der Transmission der Malaria beitragen könnte.