Sortierung von Membranproteinen: Einfluss N-terminaler Signale am Beispiel kleiner viraler Kalium-Kanäle

• Main Author: von Chappuis, Charlotte
• Format: Others
• Language: German; de
• Published: 2013
• Online Access: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/3329/1/2013_03_06.pdf; von Chappuis, Charlotte <http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/view/person/von_Chappuis=3ACharlotte=3A=3A.html> (2013): Sortierung von Membranproteinen: Einfluss N-terminaler Signale am Beispiel kleiner viraler Kalium-Kanäle.Darmstadt, Technische Universität, [Ph.D. Thesis]

Die Sortierung von Membranproteinen im eukaryotischen Zelltyp ist maßgeblich abhängig von Protein-codierten Signalsequenzen. Um den Mechanismus der Signalsequenz-abhängigen Sortierung zu sehr unterschiedlichen Zielen wie der Plasmamembran und den Mitochondrien besser zu verstehen, wurden in dieser Arbeit die beiden viralen Kalium-Kanäle PBCV1-Kcv und Kesv als Sortierungswerkzeug eingesetzt. Beide Proteine sind strukturell gekennzeichnet durch zwei Transmembrandomänen pro Untereinheit, die in einer tetrameren Anordnung ein funktionelles Protein aufbauen. PBCV1-Kcv aus dem Paramecium Bursaria Chlorella Virus 1und Kesv aus dem Ectocarpus Siliculosus Virus zeigen trotz eines hohen Grades an Homologie bezüglich Stuktur und Funktion im heterologen Expressionssystem HEK293 eine unterschiedliche zelluläre Sortierung. Während PBCV1-Kcv in der Plasmamembran lokalisiert werden konnte, wurde Kesv in der inneren mitochondrialen Membran lokalisiert (Balss et al. 2008). Um diese unterschiedliche Sortierung besser zu verstehen, wurden Lokalisationsstudien mit Hilfe von fluoreszenzmarkierten PBCV1-Kcv/Kesv-Chimären durchgeführt, mit denen folgende Erkenntnisse gewonnen werden konnten: Die post-translationale Sortierung von Kesv in die innere mitochondriale Membran ist sehr empfindlich und toleriert Mutationen nur in sehr kleinem Umfang. Daher wird fast die gesamte Kesv-Sequenz benötigt, um das Protein zielsicher in die Mitochondrien zu transportieren. Dagegen ist die post-translationale Sortierung von PBCV1-Kcv in die Plasmamembran über den sekretorischen Weg wenig störanfällig. Die Sortierung von PBCV1-Kcv wird stark geleitet durch die Signalsequenz M26-D68 Kcv, welche im letzten Drittel der ersten Transmembrandomäne lokalisiert werden konnte. Wird diese Signalsequenz von PBCV1-Kcv an gleicher Position in Kesv eingesetzt, erfolgt eine Sortierung dieser PBCV1-Kcv/Kesv Chimäre (hier Chim3.3 genannt) in die Plasmamembran. Scheinbar können sämtliche noch vorhandene mitochondriale Sortierungssignale, die durch die flankierenden Kesv-Sequenzabschnitte codiert werden das starke Sortierungssignal von PBCV1-Kcv in seiner Funktion nicht beeinflussen. Wird diese starke Signalsequenz von PBCV1-Kcv in einem schrittweisen Aminosäuren-Austausch gegen die Sequenz von Kesv ersetzt kann nach einem Austausch der ersten drei Aminosäuren wieder eine mitochondriale Sortierung erzielt werden. Der Wechsel in der Sortierung kann deshalb auf einen Sequenzabschnitt von 3 Aminosäuren eingegrenzt werden. Chim3.3 (M1-L49Kesv+M26-D68Kcv+L92-K124Kesv) wird noch in den sekretorischen Weg sortiert. Chim3.4 (M1-V50Kesv+I27-D68Kcv+L92-K124Kesv) zeigt keine eigenständige Sortierung und Chim4 (M1-V51Kesv+Y28-D68Kcv+L92-K124Kesv) kann wieder in den Mitochondrien lokalisiert werden. Die noch fragile mitochondriale Sortierung von Chim4 sowie die mitochondriale Sortierung von Kesv-wt können in einer Ko-Expression mit einem mitochondrialen Referenzprotein COXVIII::mKate2 sichtbar stabilisiert werden. Ein bisher unbekanntes Sortierungs-Phänomem kann mit der Sortierung von Chim3.4 beschrieben werden: Wie schon erwähnt verbleibt das Kanal Protein in alleiniger heterologer Expression unsortiert im Cytosol. Jedoch in Anwesenheit des Fluoreszenzproteins mKate2 zeigt die Chimäre eine Ko-Sortierung, dem Fluoreszenzprotein mKate2 folgend. Bei einer Fusion von mKate2 mit einer Kompartment-spezifischen Signalsequenz erfolgt eine gerichtete Sortierung von mKate2 in die Mitochondrien oder in das ER, der sich die Chimäre 3.4 anschließt. Somit kann die Sortierung des Proteins beliebig durch die Protein-Protein-Interaktion zwischen Chim3.4 und mKate2 gesteuert werden. Auf der Basis dieser Daten kann spekuliert werden, dass auch kleine zelluläre Proteine ohne eigene Sortierungssequenz mittels anderer Proteine in ein definiertes Kompartiment sortiert werden können.