Selektion von Lassa Fieber Virus spezifischen single chain Fv Antikörperfragmenten aus einer Immun-Antikörperbibliothek mittels Phage Display

• Main Author: Karpenko, Nataliya
• Format: Others
• Language: German; de
• Published: 2011
• Online Access: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/2965/4/Dissertation_Nataliya_Karpenko.pdf; Karpenko, Nataliya <http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/view/person/Karpenko=3ANataliya=3A=3A.html> (2011): Selektion von Lassa Fieber Virus spezifischen single chain Fv Antikörperfragmenten aus einer Immun-Antikörperbibliothek mittels Phage Display.Darmstadt, Technische Universität, [Ph.D. Thesis]

Durch die zunehmende Globalisierung, eine stark erhöhte individuelle Mobilität sowie durch eine Veränderung der Umwelt und des Lebensstils der Menschen in den letzten Jahrzehnten muss eine ganze Reihe von Infektionen als klinisch neue Erkrankungen definiert werden. Zu solchen Erregern gehört auch das in West Afrika endemische Lassa Fieber Virus (LASV), ein Vertreter der Gruppe der Negativ-Strang RNA Viren, welches ein schweres hämorrhagisches Fieber auslöst. Gegenwärtig existieren weder eine Prophylaxe, eine spezifische Therapie noch ein Impfstoff gegen das LASV. Zudem erfordern die Diagnostik sowie Erforschung von Lassa Viren besondere Schutzmaßnahmen und Vorkehrungen, da aufgrund der hohen Übertragungsrate von Mensch zu Mensch und der hohen Sterblichkeitsrate das Lassa Fieber Virus in die höchste biologische Sicherheitsstufe BSL-4 eingeordnet ist. Obwohl die protektive Wirkung Virus-neutralisierender Antikörper in unabhängigen Studien sowohl am Tiermodell und als auch mit infizierten Menschen mehrfach demonstriert wurde, stehen aktuell nur wenige nicht käufliche Antikörper gegen Lassa-virale Proteine zur Verfügung und über deren Entstehung, Eigenschaften sowie Kinetik bei der Kontrolle der Virämie ist kaum etwas bekannt. Deshalb sollte im Rahmen dieser Arbeit die humorale Antwort eines LASV-infizierten Patienten, welcher die Erkrankung überlebte, eingehenend analysiert werden. Ausgangspunkt dieser Arbeit war ein im Juli 2006 an hämorrhagischem Lassa Fieber erkrankter Patient aus Sierra Leone. Der Patient wurde erfolgreich mit Ribavirin therapiert. Während der nachfolgenden Untersuchungen im Zeitraum vom 2006 bis 2010 wurden insgesamt fünf Blutproben entnommen, welche hinsichtlich der Bindungs- sowie Neutralisationseigenschaften der Antikörper in verschiedenen Assays untersucht wurden. Es konnten in vier der fünf Serumproben sowohl bindende als auch neutralisierende Antikörper ermittelt werden. Ziel dieser Arbeit war es eine scFv-Immunbibliothek aus den B-Lymphozyten des Patienten, aus welcher über Biopanning Virus-spezifische scFv-Fragmente isoliert wurden, zu erstellen. Parallel wurde eine weitere naive Bibliothek HAL4/7 für die Selektion positiver scFs seitens der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Dübel (TU Braunschweig) zur Verfügung gestellt. Als Grundlage für eine Selektion dienten zum einen die mithilfe der Pseudotypisierung hergestellten, retroviralen heterologen LASV Partikel und zum anderen lösliche, mittels humaner Zellen exprimierte, virale Glykoproteine 1, welche in Kooperation mit Prof. Dr. S. Kunz am Institut de Microbiologie, Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (Lausanne, Schweiz) erzeugt wurden. Da pseudovirale Partikel das native Target darstellen, galt diesem Ansatz ein besonderes Interesse. Die Voraussetzung für eine erfolgreiche Selektion der spezifischen scFv war die Immobilisierung der viralen Partikel an geeignete Trägermoleküle. Im Laufe der Arbeit wurden verschiedene Methoden entwickelt und getestet. Am erfolgreichsten erwies sich dabei die Biotinylierung der Partikel mit anschließender Immobilisierung über Streptavidin. Nach der Etablierung der Immobilisierungsmethode für virale Partikel erfolgte das Screening der Immunbibliothek, wobei eine Anreicherung LASV spezifischer scFv stattfand. Durch die Selektion konnten vier positive Klone isoliert werden. Die Sequenzanalyse dieser Klone zeigte, dass es sich dabei um drei verschiedene Fragmente handelt, da zwei der vier scFv (D1 und D8) die gleiche Sequenz aufweisen. Interessant ist, dass das zweifach vorkommende Fragment eine verkürzte schwere Kette hat. Die identifizierten scFv wurden in E. coli exprimiert und die scFv-haltigen bakteriellen Überstände wurden nach der Aufreinigung auf Neutralisation von LASV getestet. Bei dem Neutralisationsassay zeigten zwei der drei Klone eine deutliche Verringerung der Infektion um ca. 40%. Bei der Selektion der naiven Bibliothek HAL4/7 konnten weitere Klone isoliert werden, deren Bindungskapazitäten jedoch relativ gering waren. Dennoch wurden die identifizierten scFv-Fagmente in Neutralisationstests eingesetzt, wobei sich zeigte, dass zwei von neun Klonen als eindeutig neutralisierend deklariert werden konnten. Eine anschließende Sequenzanalyse ergab jedoch nur eine Konsensussequenz, welche als C8/B5 Klon bezeichnet wurde. In Gegenüberstellung mit den Sequenzen der Klone aus der Immunbibliothek konnten keine Übereinstimmungen bzw. Homologien festgestellt werden. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit ein experimentell nicht angewandtes System etabliert werden, welches durch Verwendung geeigneter LASV Hüllproteintargets, sowie der Antikörper-Phagenbanken erlaubt, LASV-spezifische Antikörper zu selektieren. Somit können diese in Hinsicht auf ihren Ansatz für diagnostische und therapeutische Anwendungen analysiert werden.