Untersuchungen zur Regulation von Promotoren aus halophilen Archaea mit dem bgaH-Reportergen

• Main Author: Gregor, Dagmar
• Format: Others
• Language: German; de
• Published: 2003
• Online Access: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/293/1/Gregor-Dissertation.pdf; Gregor, Dagmar <http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/view/person/Gregor=3ADagmar=3A=3A.html> : Untersuchungen zur Regulation von Promotoren aus halophilen Archaea mit dem bgaH-Reportergen. [Online-Edition] Technische Universität, Darmstadt [Ph.D. Thesis], (2003)

In dieser Arbeit wurden die Promotoren der Gene p-gvpA, c-gvpA und fdx aus Halobacterium salinarum und des mc-gvpA-Gens aus Haloferax mediterranei mit dem bgaH-Reportergensystem untersucht. Die gvpA-Promotoren stammen aus den entsprechenden vac-Regionen, die für die Bildung von Gasvesikeln notwendig sind. Die Stärke der gvpA-Promotoren aus den drei vac-Regionen wurde quantifiziert und die Regulation ihrer Transkription näher untersucht. Dazu wurden die Promotoren mit dem bgaH-Leserahmen fusioniert und die basalen Aktivitäten der gvpA-Promotoren in Haloferax volcanii-Transformanten ermittelt. Es zeigte sich, dass der Promotor von p-gvpA (pA-Promotor) konstitutiv aktiv war, der Promotor von mc-gvpA (mcA-Promotor) eine geringe Aktivität besaß und der Promotor von c-gvpA (cA-Promotor) keine basale Aktivität hatte. Ebenso wurde die Aktivität der drei Promotoren bei Anwesenheit des GvpE-Aktivators in Hf. volcanii-Transformanten bestimmt. Es wurde dabei die Wirkung aller drei GvpE-Aktivatoren auf alle drei gvpA-Promotoren untersucht. Sowohl der mcA- als auch der pA-Promotor waren durch die drei GvpE-Proteine pGvpE, mcGvpE und cGvpE aktivierbar. Der cA-Promotor war dagegen nur durch das homologe cGvpE aktivierbar. Im Vergleich der Promotoren war der mcA-Promotor am stärksten aktivierbar, wohingegen der cA-Promotor am schwächsten aktivierbar war. An den A-Promotoren wurden auch die konservierten Sequenzen des BRE-Elements und der TATA-Box verändert, um zu testen ob diese Veränderungen einen Einfluss auf die basale Aktivität der Promotoren haben. Dem cA-Promotor, der eine kaum konservierte TATA-Box und ein kaum sichtbares BRE-Element besitzt, wurde durch Substitutionsmutation die gut konservierte TATA-Box, bzw. das gut konservierte BRE-Element des pA-Promotors, bzw. beide Elemente eingesetzt. Dieser mutierte cA-Promotor hatte zwar jeweils keine basale Aktivität, war aber besser durch GvpE aktivierbar. Somit genügten weder eine gut konservierte TATA-Box, noch ein gut konserviertes BRE-Element, noch die Kombination aus beiden, damit der cA-Promotor eine basale Aktivität zeigt. Alle Varianten führten aber zu einer verbesserten Aktivierbarkeit durch GvpE. Mit Hilfe von Mutationen wurde ein Bereich auf den gvpA-Promotoren identifiziert, der wichtig für die Aktivierung durch das GvpE-Protein ist. Es wurde ein chimärer pA-cA-Promotor, der die Sequenz des cA-Promotors, aber ein 21 nt langer DNA-Abschnitt strangauf der TATA-Box des cA-Promotors durch die entsprechende DNA-Sequenz des pA-Promotors ersetzt enthielt, konstruiert. In diesem 21 nt langen DNA-Abschnitt war auch das BRE-Element enthalten. Mit diesem pA-cA-Promotor konnte gezeigt werden, dass diese 21 nt lange pA-Promotor-Sequenz ausreichend für eine Aktivierung durch GvpE war und damit auch die GvpE Bindestelle beinhaltete. Es konnte ebenfalls die Wichtigkeit eines gut konservierten BRE-Elements bei der Aktivierung durch GvpE verdeutlicht werden. Der cA-Promotor enthält eine palindromische Sequenz strangauf der TATA-Box, die mutiert wurde, um den Wechselwirkungsbereich zwischen GvpE und Promotor näher zu untersuchen. Eine Deletion bewirkte den Verlust der Aktivierbarkeit des cA-Promotors. Substitutionsmutationen zeigten, dass bestimmte Nukleotide des Palindroms scheinbar unnötig für die Aktivierbarkeit waren, andere beeinflussten die Aktivierbarkeit. Der mcA-Promotor wurde ebenfalls durch Mutagenese analysiert. Der mcA-Promotor wurde mit Hilfe eines 7 nt deletionscanning über eine 49 nt lange Sequenz strangauf der TATA-Box analysiert. Es wurden 28 nt stromauf der TATA-Box, die auch das BRE-Element enthielten, identifiziert, die besonders wichtig für die Aktivierung durch GvpE waren. Auch ein Abtasten des Bereichs durch 4 nt lange Substitutionsmutationen über 34 nt strangauf des BRE-Elements konnte zeigen, dass ca. 20 nt angrenzend an das BRE-Element wichtig für die GvpE-Aktivierung waren. Damit wurden die Ergebnisse aus der Deletionsanalyse bestätigt. Auch der Einfluss der Salzkonzentration auf den mcA-Promotor aus Hf. mediterranei sowie auf den pA-Promotor und den fdx-Promotor aus Hb. salinarum wurde analysiert. Es stellte sich heraus, dass sowohl die basale Aktivität, als auch die durch mcGvpE induzierte Aktivität des mcA-Promotors bei 25% Salz im Medium höher war als bei 20% Salz. Die basale Aktivität des pA-Promotors und die durch pGvpE induzierte waren dagegen bei 20 und 25% Salz in etwa gleich. Bei 15% Salz war weder beim mcA- noch beim pA-Promotor Aktivität vorhanden. Der fdx-Promotor dagegen war bei allen drei Salzkonzentration aktiv.