Promotoranalyse des gehirnspezifisch exprimierten Gens 83.5

• Main Author: Perl, Sabine
• Format: Others
• Language: German; de
• Published: 2002
• Online Access: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/251/1/Perl.pdf; Perl, Sabine <http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/view/person/Perl=3ASabine=3A=3A.html> (2002): Promotoranalyse des gehirnspezifisch exprimierten Gens 83.5.Darmstadt, Technische Universität, [Online-Edition: http://elib.tu-darmstadt.de/diss/000251 <http://elib.tu-darmstadt.de/diss/000251> <official_url>],[Ph.D. Thesis]

In unserem Arbeitskreis wurde auf der Suche nach Blut-Hirn-Schranke spezifischen Expressionsprodukten zwei bisher noch nicht beschriebene mRNA-Sequenzen (tmp 83.5 und sp 83.5) isoliert. In situ Hybridisierungen und immunhistochemische Untersuchungen zeigten, dass beide Transkripte in unterschiedlichen Neuronentypen der Groß- und Kleinhirnrinde des Schweins gebildet werden. Die Transkripte codieren höchstwahrscheinlich für ein noch nicht beschriebenes potenzielles Transmembranprotein (TMP 83.5) sowie für dessen lösliche Isoform (SP 83.5). Die mRNA-Sequenzen werden von einem 21,7 kb langen Gen (Gen 83.5) unter der Nutzung alternativer Promotoren gebildet. Interessanterweise existiert zu dem porcinen Gen 83.5 eine humane Genvariante sowie eine korrespondierende mRNA tmp 83.5. Das humane Gen HTMP10 ist auf Chromosom 10 in einem Bereich lokalisiert, der im engen Zusammenhang mit neuronalen Fehlfunktionen steht. In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst der Transkriptionsstartpunkt des Transkripts sp 83.5 in Primer Extension Analysen bestimmt. Die computergestützte Sequenzanalyse der resultierenden Promotorregion ergab, das diese zahlreiche Bindungsstellen neuronaler und gehirnspezifischer Transkriptionsfaktoren enthält. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Promotor tmp 83.5 analysiert. Zum Nachweis funktioneller regulatorischer Sequenzelemente im Promotor tmp 83.5 sowie in der 5`-nichttranslatierten Region (5`-UTR) wurde eine Serie von Promotortestplasmiden mit zunehmenden 5`-Deletionen des Wildtyp-Promotors tmp 83.5 generiert. Die Expressionsraten dieser Promotorvarianten wurden in neuronalen Zellinien sowie im Vergleich hierzu in einer nichtneuronalen Zellinie untersucht. Mit den Ergebnissen dieser Deletionsstudien konnten verschiedene funktionelle Bereiche im Promotor eingegrenzt werden, die für eine zellspezifische bzw. allgemeine Aktivierung respektive Repression des Gens 83.5 verantwortlich sind. Mit DNase I Footprinting- und Band Shift-Analysen konnten in vitro sequenzspezifische Protein-Bindungen im Bereich des Kern- und proximalen Promotors tmp 83.5 nachgewiesen werden. Anhand der erhaltenen Ergebnisse wurde ein Modell für die Regulation des Promotors tmp 83.5 aufgestellt. Es umfasst neben einen ubiquitären Enhancer in der 5’-nichttranslatierten Region einen neuronspezifischen Aktivator und Repressor im distalen Promotor sowie Bindungsstellen für induzierbare und neuronspezifische Transkriptionsfaktoren im proximalen Promotor.