STRUKTUR-FUNKTIONS-BEZIEHUNG VIRALER KALIUMKANÄLE Einfluss der Transmembrandomänen auf die Funktion und Sortierung von Kaliumkanälen

• Main Author: Baumeister, Dirk
• Format: Others
• Language: German; de
• Published: 2010
• Online Access: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/2199/1/Dissertation_-_Dirk_Baumeister.pdf; Baumeister, Dirk <http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/view/person/Baumeister=3ADirk=3A=3A.html> (2010): STRUKTUR-FUNKTIONS-BEZIEHUNG VIRALER KALIUMKANÄLE Einfluss der Transmembrandomänen auf die Funktion und Sortierung von Kaliumkanälen.Darmstadt, Technische Universität, [Ph.D. Thesis]

Die Funktion von Ionenkanälen ist für zahlreiche zelluläre Prozesse essentiell und spielt sowohl in der biologischen, als auch in der medizinischen Forschung eine immer wichtigere Rolle. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Struktur/Funktions-Beziehungen der zwei minimalen viralen Kaliumkanäle Kcv und Kesv untersucht. Im besonderen Fokus stand auf der einen Seite die Aufklärung des molekularen Gating-Mechanismus des Kcv-Kanals und auf der anderen Seite die Untersuchung des veränderten targetings des Kesv-Kanals. Die elektrophysiologische Charakterisierung von Kcv-Mutanten, deren äußere Transmembrandomäne (TM1) um je ein Alanin verlängert wurde, konnte drei Beiträge zum Verständnis der Struktur/Funktions-Beziehung von Kcv leisten: (i) schnelles und langsames Gating sind zwei voneinander unabhängige Prozesse, (ii) die TM1 von Kcv weist eine funktionelle Gliederung auf und (iii) das langsame Gating basiert auf Salzbrückeninteraktionen zwischen dem C-Terminus der TM2 und dem N-terminalen Proteinabschnitts. Mit Hilfe von temperaturabhängigen Messungen konnten erstmalig experimentelle Daten gewonnen werden, die nahe legen, dass Salzbrückeninteraktionen die molekulare Grundlage für das langsame Gating bilden. Die Energiebarriere, die beim Gating überwunden werden muss, liegt mit 45 ± 2,5 KJ/mol bei -140 mV auf einem Niveau, das dem Aufbrechen von Salzbrücken entspricht. Dies wird zudem durch den Befund bestärkt, dass die entsprechenden Mutationen im Bereich von möglichen Salzbrücken zwischen den Transmembrandomänen liegen. Ein Gating-Modell von Kcv über Salzbrücken basiert demzufolge darauf, dass der Kanal bei geschlossener Salzbrücke offen ist. Sobald die Salzbrücke aufbricht, werden Kaliumionen durch die nun freie Carboxylgruppe des C-Terminus abgefangen, so dass es zu einem „Kaliumblock“ für den Austritt von Kaliumionen aus der Cavität des Kaliumkanals kommt. Dem Modell zufolge wird der Kanal spannungsabhängig geöffnet indem sich bei negativer Spannung mehr Salzbrücken bilden, die somit mehr Kanäle öffnen. Dies resultiert in einer langsamen Aktivierung des Stroms, wie es bei den Insertionsmutanten von Kcv beobachtet wurde. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden die Signale für eine intrazelluläre Sortierung des zweiten viralen Kaliumkanals Kesv untersucht. Dazu wurde die Methode der randomized site directed PCR entwickelt. Diese Technik ist in Kombination mit der Hefekomplementation als Selektionsverfahren geeignet, um mittels Directed Evolution definierte Proteinabschnitte zu randomisieren, um so unvoreingenommen nach funktionellen Mutanten zu screenen. Es zeigte sich, dass eine Insertion von 3 Aminosäuren an Position 113 von Kesv nur bei wenigen Konstrukten zu einer Redirektionierung des targetings von den Mitochondrien zur Plasmamembran führt. Die Analyse der positiven Mutanten ergab, dass der Sequenzbereich, der das targeting bestimmt weitgehend sequenzunspezifisch ist; das veränderte targeting basiert vor allem auf einer strukturellen Verlängerung der äußeren Transmembrandomäne. Insgesamt unterstreichen die Ergebnisse, dass die neu entwickelte Randomisierungsmethode gut geeignet ist um unvoreingenommene, willkürliche Mutationen in definierte Proteinabschnitte einzufügen und deren Struktur/Funktions-Zusammenhänge zu untersuchen.