Analyse von Atmungskettenkomplexen aus Organellen von Chlamydomonas reinhardtii und Rattus norvegicus

• Main Author: Schwaßmann, Helena J.
• Format: Others
• Language: German; de
• Published: 2010
• Online Access: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/2150/2/DissertationHSchwassmann.pdf; Schwaßmann, Helena J. <http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/view/person/Schwa=DFmann=3AHelena_J=2E=3A=3A.html> (2010): Analyse von Atmungskettenkomplexen aus Organellen von Chlamydomonas reinhardtii und Rattus norvegicus.Darmstadt, Technische Universität, [Ph.D. Thesis]

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Anordnung mitochondrialer Atmungskettenkomplexen zu sogenannten Superkomplexen und mit der aus Chloroplasten stammenden FoF1-ATP-Synthase. Hierbei wird insbesondere die Veränderung in der Oligomerisierung der FoF1-ATP-Synthase sowie in der Superkomplexbildung durch veränderten Metabolismus (Chlamydomonas reinhardtii) und durch den Einfluss des Alterns (Rattus norvegicus) untersucht. Das Mitochondrium ist als das Kraftwerk der Zelle bekannt, denn es beherbergt neben den Enzymen des Citratzyklus und der Fettsäuresynthese auch die fünf Proteinkomplexe der Atmungskette in ihrer inneren Membran. Vier dieser Komplexe bilden die Elektronentransportkette und bewerkstelligen die Übertragung der Elektronen von den Redoxequivalenten NADH und FADH2 auf molekularen Sauerstoff, während drei von ihnen gleichzeitig einen Protonengradienten über die innere Mitochondrienmembran aufbauen. Dieser elektrochemische Protonengradient treibt die ATP-Synthase an. Etwa 90% des ATPs, das aerobe, eukaryotische Organismen verbrauchen, wird auf diese Weise generiert; dies verdeutlicht die essentielle Wichtigkeit dieser Enzymkomplexe. Die Atmungskettenkomplexe selbst liegen nicht, wie früher allgemein, und von vielen auch heute noch angenommen, einzeln und lateral frei beweglich in der Membran vor, sondern sie lagern sich zu verschiedenen Superkomplexen zusammen. In dieser Arbeit werden mittels blau-nativer und mehrdimensionaler Gelelektrophorese sowie durch Antikörper- und Aktivitätsuntersuchungen und durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie erstmalig die Atmungskettensuperkomplexe aus Mitochondrien der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii beschrieben. Anders als alle bisher untersuchten Pflanzen bildet die Alge keinen Superkomplex a aus, der aus Komplex I (NADH:Ubiquinon-Oxidoreductase) und einem Dimer von Komplex III (Ubiquinol:Cytochrom-c-Oxidoreductase) besteht. Dagegen bildet die Alge nur zwei Atmungskettensuperkomplexe S1 und S2, die zusätzlich Komplex IV (Cytochrom-c-Oxidase) enthalten und die Stöchiometrie I1III2IV1 und I1III2IV2 besitzen; somit entsprechen sie den zuerst für Rinderherz beschriebenen Superkomplexen b und c. Die entwickelte Methodik der Gewinnung des Superkomplexes S1 (I1III2IV1) ermöglichte seine erste elektronenmikroskopische Darstellung. Neben der mitochondrialen ATP-Synthase besitzt Chlamydomonas reinhardtii eine weitere ATP-Synthase des FoF1-Typs in ihren Chloroplasten (CFoF1). Dieses Enzym ist die bislang einzige nicht-mitochondriale ATP-Synthase, für die Dimere nachgewiesen wurden. In der vorliegenden Arbeit wird durch die in vivo Markierung der Algen mit dem stabilen Stickstoffisotop 15N und einer quantitativen massenspektrometrischen Analyse gezeigt, dass die Dimerisierung der CFoF1 vom metabolischen Zustand der Zelle abhängig ist. Sie kann also - anders als mitochondriale ATP-Synthase-Dimere - eine regulatorische Funktion besitzen, die möglicherweise die ATP-Produktion der Chloroplasten herunterregelt, wenn die Zelle andere Nahrungsquellen nutzt. Der Anteil an Dimeren in Zellen, die photomixotroph wachsen, also ihre Energie aus Licht und organischen Molekülen gewinnen, liegt um das 2,5-fache höher als in den ebenfalls untersuchten photoautotrophen Zellen, die ihre Energie ausschließlich aus der Photosynthese beziehen. Eine weitere in dieser Arbeit beschriebene vergleichende quantitative Proteomanalyse wird an Ratten dreier verschiedener Altersgruppen durchgeführt. Die Atmungskettenkomplexe und Superkomplex-Zusammensetzungen wurden durch Antikörperanalysen und durch ein- und mehrdimensionale sowohl blau-native als auch denaturierende Gelelektrophorese quantifiziert. Die Experimente zeigen eine Abnahme des Gehalts an Komplex III und V im Bezug auf den Gesamtproteingehalt, im Fall von Komplex III als eine stufenweise Abnahme über die drei Altersgruppen hinweg.