Untersuchungen zur Interaktion und Lokalisation von Aquaporinen aus Nicotiana tabacum

• Main Author: Sdorra, Sven
• Format: Others
• Language: German; de
• Published: 2009
• Online Access: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/1959/1/Diss_Sven_Sdorra.pdf; Sdorra, Sven <http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/view/person/Sdorra=3ASven=3A=3A.html> : Untersuchungen zur Interaktion und Lokalisation von Aquaporinen aus Nicotiana tabacum. Technische Universität, Darmstadt [Ph.D. Thesis], (2009)

Aquaporine sind Proteine, die die Diffusion von Wasser oder kleiner, ungeladener Teilchen (wie Glycerin oder Ammoniak) durch biologische Membranen erleichtern. In Pflanzen kommen vier unterschiedliche Aquaporingruppen vor. In dieser Arbeit wurden zwei Vertreter aus der Aquaporingruppe der Plasmamembran Intrinsischen Proteine (PIP) untersucht. Diese lässt sich funktionell in die PIP1-Aquaporine, die die Membranpassage kleiner neutraler Teilchen wie CO2 erleichtern, und PIP2-Aquaporine, die hochselektiv für Wasser sind, unterteilen. Zur Regulation der Wasserdurchlässigkeit von Zellmembranen durch Aquaporine werden verschiedene Mechanismen diskutiert, so z. B. differentielle Genexpression, ein Gating-Mechanismus oder eine kooperative Regulation der Aqauporinpermeabilität durch Heteromerisierung von PIP1- und PIP2-Aquaporinen. Um zu untersuchen, ob PIP1 und PIP2 in vivo in eukaryotischen Plasmamembranen direkt miteinander interagieren, wurde in dieser Arbeit die Methode der Bimolekularen Fluoreszenz-Komplementation verwendet. Hierzu wurden Fusionsproteine aus den Tabak-Aquaporinen NtAQP1 (PIP1) und NtPIP2;1 (PIP2) mit jeweils der N-terminalen bzw. C-terminalen Hälfte von YFP fusioniert und in Saccharomyces cerevisiae exprimiert. Alle betrachteten Kombinationen (NtAQP1-YC+NtAQP1-YN; NtAQP1-YC+NtPIP2;1-YN; NtPIP2;1-YC+NtPIP2;1-YN;) führten zur Bildung von YFP-Fluoreszenz. Bei allen Kombinationen wurden sowohl Strukturen innerhalb der Zellen als auch die Plasmamembran fluoreszent markiert. Über die Quantifizierung der Fluoreszenzintensitäten konnte die Menge an exprimierten Aquaporinen in den Zellen verglichen werden. Über Kolokalisationsanalyse mit dem lipophilen Fluoreszenzfarbstoff FM4-64 konnte der relative Anteil der Aquaporine in der Plasmamembran an der Gesamtheit der exprimierten Aquaporine ermittelt werden. Es zeigt sich, dass bei Koexpression von PIP1- und PIP2-Aquaporinen mindestens 3,5 mal mehr Aquaporine in der Plasmamembran gefunden werden als bei der Expression von NtAQP1 oder NtPIP2;1 alleine. Um die Art der Wechselwirkung zwischen den beiden Aquaporinen zu charakterisieren, wurden NtAQP1-YC, NtPIP2;1 und NtAQP1-YC + NtPIP2;1 einer Dichtegradientenzentrifugation unterzogen. Es zeigte sich, dass NtAQP1-YC + NtPIP2;1 langsamer als NtPIP2;1 sedimentierte, aber schneller als NtAQP1-YC. Dies ist ein Indiz, dass die beiden verschiedenen Aquaporine miteinander Heterotetramere bilden. Der Einfluss einer Heteromerisierung auf die Wasser- bzw. CO2-Permeabilität der Aquaporine wurde über Stopped Flow Spektrophotometrie bzw. -fluorometrie untersucht. Die Permeabilitäten der Membranen, in die die Aquaporine inseriert wurden, waren durch die Bildung des YFP gegenüber der Permeabiltität von Membranen, in die unfusionierte Proteine integriert waren, erheblich reduziert. Durch Korrelation der ermittelten Permeabilitätskoeffizienten mit dem relativen Anteil der Aquaporine in der Plasmamembran wurde gezeigt, dass die relativ hohe Wasserdurchlässigkeit von Membranen bei Koexpression von PIP1- und PIP2-Aquaporinen aus einem gesteigerten Einbau von PIP2 in die Plasmamembran resultiert. Aber die Wasserpermeabilität der PIP2-Aquaporine in Heteromeren ist im Vergleich zu der in PIP2-Homomeren dramatisch reduziert. PIP1-Aquaporine zeigten keine Wasserleitfähigkeit, ihr Einbau in die Membranen der Hefen scheint allerdings deren Kohlendioxidpermeabilität zu erhöhen. Kommt es bei Koexpression von PIP1 und PIP2 zur Heteromerisierung, so verringert sich dieser Einfluss der Aquaporine auf die CO2-Permeabilität der Plasmamembran ebenso drastisch wie die Wasserpermeabilität der PIP2-Aquaporine bei PIP1-PIP2-Koexpression.