Charakterisierung von Zellwandproteinen des Transglutaminase-Produzenten Streptomyces mobaraensis
Streptomyceten sind Gram-positive Eubakterien mit einem ausgeprägten Sekundärmetabolismus, die für das Wachstum Nährstoffe durch Zersetzung vorhandener Makromoleküle in Boden und Gewässern gewinnen. Dabei durchlaufen sie komplexe Differenzierungsphasen, in denen nährstoffanreicherndes Substrat- und...
| Summary: | Streptomyceten sind Gram-positive Eubakterien mit einem ausgeprägten Sekundärmetabolismus, die für das Wachstum Nährstoffe durch Zersetzung vorhandener Makromoleküle in Boden und Gewässern gewinnen. Dabei durchlaufen sie komplexe Differenzierungsphasen, in denen nährstoffanreicherndes Substrat- und reproduktives Luftmycel, das mit der Sporenbildung endet, entstehen. Streptomyces mobaraensis unterscheidet sich von anderen Streptomyceten durch die Produktion des Proteinvernetzungsenzyms Transglutaminase, dessen physiologische Funktion noch wenig untersucht ist. Gegenstand der vorliegenden Arbeit war die Charakterisierung amphiphiler Oberflächenproteine der Lufthyphen und Sporen von S. mobaraensis, bezeichnet als Chapline und Rodline, sowie ihre Interaktion mit Transglutaminase. Dazu wurde zunächst für das lange Chaplin 1 (Sm-Chp1) und Rodlin 1 (Sm-Rdl1), als Vertreter der zwei Proteinklassen, ein effektives Produktionsverfahren zur Herstellung in E. coli etabliert. Untersuchungen mittels CD- und Fluoreszenzspektroskopie zeigten, dass beide Proteine eine ungeordnete Struktur in Lösung besitzen, die sich bei erhöhter Exposition an der Luft/Wasser-Grenzfläche in eine β-Faltblatt-reiche, amyloide Struktur umwandelt. Sm-Chp1 als auch Sm-Rdl1 bilden einen stabilen Proteinfilm an der Luft/Wasser-Grenzfläche aus und besitzen eine hohe Oberflächenaktivität, wie durch Experimente mit einem Langmuir-Trog nachgewiesen wurde. Über den enzymatischen Einbau von Monobiotinylcadaverin wurden beide Proteine in Lösung als Glutamindonor-Substrate der Transglutaminase identifiziert. Besonders Sm-Chp1 erwies sich als ein exzellentes Substrat im Vergleich mit bisher untersuchten Glutamindonor-Substraten von S. mobaraensis, was auch auf die ungeordnete Struktur von Sm-Chp1 zurückgeführt wurde. Der Austausch einzelner Glutamine gegen Asparagin über ortsgerichtete Mutagenese zeigte, dass Glutamine innerhalb der Chaplin-Domänen modifiziert wurden. Unter der Annahme, dass deren Zugänglichkeit im gefalteten Zustand von Sm-Chp1 eingeschränkt sein sollte, wurden erste Versuche unternommen, über die druck-induzierte Assemblierung von Sm-Chp1 an der Luft/Wasser-Grenzfläche im Langmuir-Trog die natürliche Faltung zu simulieren. Nach dem Transfer der Sm-Chp1-Filme auf eine hydrophobe Membran erfolgte die Transglutaminase-vermittelte Biotinylierung, welche noch nicht zu einem zweifelsfreien Ergebnis führte. Weiterhin wurde für Sm-Chp1 mittels biochemischer Methoden Metallbindungseigenschaften für Nickel, Zink und Kupfer nachgewiesen. Diese wurden dabei auf ausgedehnte Histidin-reiche Domänen zurückgeführt, durch die sich Sm-Chp1 von Sc-ChpC aus S. coelicolor A3(2) unterscheidet. Isothermale Titrationskalorimetrie und andere Methoden legten eine Bindekapazität von sieben bis acht Metallionen und Dissoziationskonstanten im mikromolaren Bereich für Nickel und Zink nahe. Damit gehört Sm-Chp1 zu den noch wenig charakterisierten Proteinen, die sich an der Versorgung von Enzymen mit essentiellen Metallen beteiligen und deren Proteinstruktur an den Metallbindestellen wegen der hohen Flexibilität von Histidin-reichen Domänen unbekannt ist. In einem Nebenprojekt erfolgte die Charakterisierung einer Sortase der Klasse E aus S. mobaraensis, der Sm-SrtE2, wofür zunächst ein Produktionsverfahren für die Herstellung in E. coli etabliert wurde. Das Enzym wies eine geringe Stabilität auf, welche vermutlich durch Entfernung des N-terminalen Membranankers entstand. Die im Vergleich mit anderen Proteinen aus S. mobaraensis niedrige Temperaturresistenz spricht für eine stabilisierende Funktion dieser Domäne. Der Nachweis der Aktivität, welche unabhängig von Metallionen ist, erfolgte durch die Spaltung von FRET-Pentapeptiden, die putative Sortaseerkennungsmotive beinhalteten. Das Pentapeptid LAETG war das bevorzugte Substrat der Sm-SrtE2. Die Transpeptidierungsaktivität wurde zusätzlich durch Fluoreszenzmarkierung des intrinsischen Substratproteins Sm-Chp1 mit dem Motiv LAHTG nachgewiesen. Dabei erwies sich Sm-Chp1 als ein besseres Substrat im Vergleich mit Sc-ChpC von S. coelicolor, welches das Sortaseerkennungsmotiv LAETG besitzt. Die Effizienz der Sm-SrtE2 ist offensichtlich auch von der Struktur des Substratproteins und weiteren Aminosäuren abhängig, die das Sortaseerkennungsmotiv flankieren. Die Transglutaminase-vermittelte Biotinylierung der N-terminalen Glutamine resultierte vermutlich aus der Einkürzung der Sm-SrtE2, was einen unstrukturierten, flexiblen N-Terminus ergab. Durch die N-terminale Verankerung des Enzyms in der Membran sollte Transglutaminase in vivo keine Wechselwirkung mit Sm-SrtE2 eingehen können. |
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