Technologie µLAS pour l'analyse et la purification d'ADN de haut poids moléculaire

• Main Author: Milon, Nicolas
• Other Authors: Toulouse, INSA
• Language: fr
• Published: 2019
• Subjects: ADN; Purification; Séquençage; Séparation; Concentration; Haut poids moléculaire; Isolation; DNA; High molecular weight; Separation; Sequencing; 532.3; 572.36; 572.8; 572.86
• Online Access: http://www.theses.fr/2019ISAT0005

Les techniques de séquençage ont connu un extraordinaire développement depuis plus de 40 ans et ont permis une véritable révolution dans le domaine de l’analyse biologique avec l’entrée dans l’ère de la génomique. Le développement de nouvelles méthodes de séquençage est néanmoins associé à des contraintes sur la préparation et le contrôle qualité des échantillons d’ADN. La 3ème génération de séquenceurs nécessite notamment l’utilisation de fragments d’ADN de très grande taille, supérieurs à 50000 paires de bases, qui sont complexes à préparer et à caractériser avec les techniques actuelles. Dans la perspective d’accélérer et d’améliorer ces procédures de préparation d’échantillons, nous avons développé un instrument basé sur la technologie µLAS permettant la concentration et la séparation de grands fragments d’ADN. Nous avons en particulier développé une méthode permettant la concentration, l’isolation et le séquençage de régions génomiques ciblées en les découpant avec l’enzyme de restriction Cas9. Nous avons également développé un prototype pour la purification d’ADN de haut poids moléculaire dans un mélange complexe. Cet instrument permet d’effectuer une vanne de sélection d’ADN accordable pilotée par champ électrique. Adaptée à l’enrichissement sélectif d’ADN selon sa taille de 200 bp à 50 000 bp, notre méthode permet d’effectuer une purification de 20 ng d’ADN génomique de taille supérieure à 20 kb avec la technologie de 10X Genomics. Nous avons ainsi montré le potentiel de la technologie µLAS dans l’analyse et la purification d’ADN de haut poids moléculaire. === In forty years only, DNA sequencing technologies triggered a revolution in biological analysis with the beginning of the genomic era. Nevertheless, this booming technological field is still hampered by unmet technological needs for DNA sample preparation and quality control. The most recent third generation sequencing technologies require very long DNA fragments of more than 50,000 base pairs, the manipulation and characterization of which remains a technological challenge. In the prospect of accelerating and improving state of the art protocols for sample preparation, we developed an instrument, based on the µLAS technology that allows the concentration and separation of high molecular weight DNA fragments with high sensitivity. With this technology, we developed a method for the isolation and sequencing of target genomic regions in complex genomes. We report the isolation, the sequencing and the assembly of a locus of 31.5 kb extracted from the genome of the plant Medicago Truncatula. We finally developed a prototype for high molecular weight DNA purification in complex samples, which is based on a size-accordable DNA valve for the size selection in the range 200 – 50,000 bp. In this manuscript we highlighted the relevance of µLAS technology for the analysis and purification of high molecular weight DNA.