Exploration expérimentale du métabolisme du soufre dans le vivant

• Main Author: Bessonnet, Thomas
• Other Authors: Université Paris-Saclay (ComUE)
• Language: fr
• Published: 2018
• Subjects: Acinetobacter baylyi ADP1
• Online Access: http://www.theses.fr/2018SACLE035

Acinetobacter baylyi ADP1 (ADP1), une bactérie du sol aux capacités de dégradation des molécules aromatiques remarquables est utilisée au laboratoire comme organisme modèle pour l’élucidation de nouvelles fonctions enzymatiques et voies métaboliques. Tirant profit de deux qualités d’ADP1 (compétence naturelle et recombinaison homologue efficace), une collection complète de mutants knock-out a été obtenue. L’analyse de cette ressource génomique a fait apparaître des phénotypes non prédits par l’annotation aboutissant notamment à l’initiation de l’étude du métabolisme du soufre chez ADP1 avec deux axes : (1) la biosynthèse de la L-méthionine (L-Met) et plus spécialement l’étude des familles d’enzymes non homologues MetX et MetA catalysant l’acylation de l’homosérine dans le monde vivant, première étape de cette voie ; (2) le recyclage de la L-méthionine et les voies d’assimilation des molécules soufrées. La thèse s’inscrit dans ces deux thématiques. Tout d’abord, un vaste projet combinant criblage expérimental et analyse structurale des sites actifs de MetA et MetX avait permis précédemment d’identifier les résidus déterminant l’usage de l’acyl-CoA et de proposer des règles précises de prédiction de fonction pour ces deux familles finalement isofonctionnelles. Cette étude avait révélé entre autres que 10% des MetX n’étaient pas impliqués dans la biosynthèse de L-Met. Nous avons donc entrepris la caractérisation de ces paralogues à l’activité inédite L-sérine O-succinyltransférase (SST) et finalement impliquées dans la biosynthèse de la L-cystéine (L-Cys). Jusqu'alors, l'acétylation par les L-sérine O-acétyltransférases (SAT) était le seul moyen connu d'activer la L-sérine. La détermination des paramètres cinétiques des SST ainsi que la caractérisation par LCMS in vitro puis la détection in vivo d’O-succinyl-L-sérine (OSS) dans les métabolomes de la levure Schizosaccharomyces pombe et la bactérie Xanthomonas campestris ont permis de démontrer la fonction de ces paralogues. Pour compléter la démonstration, la caractérisation des cystéine synthases (CysK) respectives a montré qu’elles effectuent en effet la sulfhydrylation de l’OSS pour former de la L-Cys. Notre étude a ainsi également révélé que la voie décrite de la biosynthèse de la L-cystéine chez les levures jusqu’alors extrapolée à partir de la levure modèle Saccharomyces cerevisae (voie de transsulfuration réverse) était en réalité une exception et que la grande majorité des levures synthétisent la L-Cys à partir de la L-sérine via ce nouveau métabolite, l’OSS. Cette thèse, dans un deuxième temps, a initié l’exploration expérimentale des voies d’assimilation du soufre chez ADP1 chez qui notamment aucune voie de recyclage de la L-Met n’était prédite alors qu’elle y est source de soufre. Combinant des approches complémentaires (génétique inverse par phénotypage de la collection complète de mutants sur diverses sources de soufre, transcriptomique sur L-Met et L-Cys versus sulfate, criblage des enzymes à PLP d’ADP1 potentiellement impliquées, étude biochimique des candidats et construction de mutants d’ADP1), une image assez précise des voies d’assimilation de diverses sources de soufre se dessine. Par exemple, les voies d’assimilations de la L-Met et du DMSP semblent aboutir à la production de sulfite via la synthèse de méthanesulfonate sous le contrôle du régulateur transcriptionnel CBL. De plus, le KMBA et le méthanethiol sont probablement des intermédiaires de la voie de recyclage de la L-Met, alors que le DMSO et le DMSO2 semblent être des intermédiaires cataboliques uniquement pour le DMSP. === Acinetobacter baylyi ADP1 (ADP1), a soil bacterium with remarkable aromatic molecule degradation capacities is used in the laboratory as a model organism for the elucidation of new enzymatic functions and metabolic pathways. Taking advantage of two qualities of ADP1 (natural competence and effective homologous recombination), a complete collection of knock-out mutants has been obtained. Analysis of this genomic resource revealed unpredicted phenotypes by the annotation, leading in particular to the initiation of the study of sulphur metabolism in ADP1 with two axes: (1) the biosynthesis of L-methionine (L-Met) and more specifically the study of the families of non-homologous MetX and MetA enzymes catalysing the acylation of homoserine, the first step of this pathway; (2) the recycling of L-methionine. The thesis falls within these two themes. First, a vast project combining experimental screening and structural analysis of the active sites of MetA and MetX had previously made it possible to identify the residues determining the use of acyl-CoA and to propose precise function prediction rules for these two finally isofunctional families. Among other things, this study revealed that 10% of MetX were not involved in L-Met biosynthesis. We have therefore undertaken the characterization of these paralogues with novel activity L-serine O-succinyltransferase (SST) and finally involved in the biosynthesis of L-cysteine (L-Cys). Until then, acetylation by L-serine O-acetyltransferases (SAT) was the only known way to activate L-serine. The determination of kinetic parameters of SST as well as in vitro LCMS characterization and in vivo detection of O-succinyl-L-serine (OSS) in the metabolomes of Schizosaccharomyces pombe yeast and Xanthomonas campestris bacterium demonstrated the function of these paralogues. To complete the demonstration, the characterization of the respective cysteine synthases (CysK) showed that they indeed perform sulfhydrylation of OSS to form L-Cys. Our study also revealed that the described pathway of L-cysteine biosynthesis in yeasts hitherto extrapolated from the model yeast Saccharomyces cerevisae (reverse transsulfuration pathway) was actually an exception and that the vast majority of yeasts synthesize L-Cys from L-serine via this new metabolite, OSS. This thesis, in a second stage, initiated the experimental exploration of sulphur assimilation pathways in ADP1, in which no L-Met recycling pathway was predicted even though it is a source of sulphur. Combining complementary approaches (reverse genetics by phenotyping the complete collection of mutants on various sulphur sources, transcriptomics on L-Met and L-Cys versus sulphate, screening of ADP1 PLP enzymes, biochemical study of ADP1 candidates and mutants), a fairly accurate picture of the assimilation pathways of various sulphur sources is emerging. For example, the assimilation pathways of L-Met and DMSP appear to lead to the production of sulphite via methanesulphonate synthesis under the control of the transcriptional regulator CBL. In addition, KMBA and methanethiol are probably intermediates in the L-Met recycling pathway, whereas DMSO and DMSO2 appear to be catabolic intermediates only for DMSP.