Exploration de la face cachée du métabolisme bactérien chez Acinetobacter baylyi ADP1

• Main Author: Thomas, Marion
• Other Authors: Université Paris-Saclay (ComUE)
• Language: fr
• Published: 2018
• Subjects: Acinetobacter baylyi ADP1
• Online Access: http://www.theses.fr/2018SACLE025/document

La connaissance du métabolisme demeure incomplète mais sa compréhension reste un but majeur tant pour la recherche fondamentale qu’appliquée. Environ 40% des gènes des organismes procaryotes n’ont pas de fonction précise proposée. En conséquence, de nombreuses voies métaboliques sont incomplètes et d’autres restent à découvrir. Ces lacunes rendent très difficile la modélisation et la compréhension du métabolisme d’une cellule. Le laboratoire développe une nouvelle stratégie pour mettre au jour des voies métaboliques inconnues. Celle-ci est basée sur la bactérie modèle du laboratoire, Acinetobacter baylyi ADP1 (AP1). Elle exploite la banque complète de mutants de délétion de cet organisme (2600 mutants) ainsi que les avancées récentes du laboratoire dans le domaine de la métabolomique par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse à très haute résolution (LC/MS).Cette étude est liée à l’observation que lors d’un changement de source de carbone (succinate vs quinate) ADP1 produit de nombreux métabolites d’identité inconnue, non reliés à notre connaissance de son métabolisme. Ces métabolites orphelins (MO) participent à des voies métaboliques nouvelles et représentent des points d’entrée dans la partie obscure du métabolisme bactérien.Ce projet comporte deux volets. Il s’agit d’une part de procéder à l’élucidation structurale des MO et d’autre part d’identifier l'ensemble des gènes impliqués dans leur synthèse.Dans le cadre de ce travail de thèse, nous avons établi l’identité d’un premier MO : l’acide 3-(3-aminopropylamine)- 4-hydroxybenzoïque. Ce composé est un bien métabolite nouveau, jamais référencé auparavant. Dans un premier temps, des expériences de LC/MS impliquant notamment des fragmentations séquentielles MSn et des échanges isotopiques H/D ont permis de déterminer sa composition élémentaire, son nombre de protons échangeables et ont suggéré une structure aromatique de la molécule. Ensuite, son identification a nécessité sa purification à l’échelle de la centaine de µg. Puis, une analyse RMN complète (1H, 13C, COSY, 1H-13C HSQC, 1H-13C HMBC, et 1H-15N HMBC) a permis de préciser sa structure.Par ailleurs, pour identifier les gènes impliqués dans la synthèse des MO, nous avons procédé à l’analyse métabolomique de l’ensemble des mutants de la collection d’ADP1. Pour cela, nous avons développé des protocoles à haut-débit pour la préparation des métabolomes (100 métabolomes par jour), l’acquisition des données LC/MS (8 minutes par acquisition) et enfin leur analyse automatisée. Nous regardons, pour chaque mutant, quels sont les MO présents et absents. L’absence d’un MO chez un mutant donné indique que le gène excisé est impliqué dans sa synthèse. L’analyse systématique de la banque doit permettre in fine de dresser la liste de tous les gènes impliqués dans la synthèse de chaque MO. Les résultats du criblage, toujours en cours, permettront ainsi de commencer à reconstituer ces voies métaboliques nouvelles. === Our knowledge of metabolism remains incomplete and its understanding is a major goal for both basic and applied research. About 40% of prokaryotic genes have no specific function proposed. Many metabolic pathways are therefore incomplete and others remain to be discovered. These shortcomings (ou gaps ??) make the modelling and the understanding of cell metabolism very difficult. The laboratory is developing a new strategy to uncover unknown metabolic pathways. This is based on the model bacterium Acinetobacter baylyi ADP1 (ADP1). It exploits the complete library of deletion mutants of this organism (2600 mutants) as well as the recent advances of the laboratory in the field of metabolomics by liquid chromatography coupled with very high resolution mass spectrometry (LC / MS).This study is related to the observation that during a change of carbon source (from succinate to quinate), ADP1 produces many metabolites of unknown identity, unrelated to our knowledge of its metabolism. These orphan metabolites (MO) participate in novel metabolic pathways and represent entry points into the dark part of bacterial metabolism.This project has two objectives. The first is to elucidate of the structure of MOs, and the second is to identify all the genes involved in their synthesis.As part of this thesis, we established the identity of a first MO: 3- (3-aminopropylamine) - 4-hydroxybenzoic acid. This compound is a new metabolite, never referenced before. Firstly, LC / MS experiments involving sequential fragmentation MSn and isotopic H / D exchanges allowed us to determine its elementary composition, its number of exchangeable protons and suggested an aromatic structure of the molecule. Then, its identification required its purification on the scale of the hundred μg. Then, a complete NMR analysis (1H, 13C, COZY, 1H-13C HSQC, 1H-13C HMBC, and 1H-15N HMBC) allowed us to specify the structure of the compound.Furthermore, to identify genes involved in the synthesis of MOs, we proceeded to the metabolomic analysis of all the strains of the ADP1 mutant collection. For this, we developed high-throughput protocols for the preparation of metabolomes (100 metabolomes per day), for the acquisition of LC / MS data (8 minutes per acquisition) and for their automated analysis. For every mutant, we are looking which Mos are present and which are absent. The absence of an MO in a given mutant indicates that the excised gene is involved in its synthesis. The systematic analysis of the bank should allow to list all the genes involved in the synthesis of each MO. The results of the screening, still in progress, will thus make it possible to begin to reconstitute these new metabolic pathways.