Production recombinante de récepteurs lectines de type C et identification de ligands sélectif : de nouveaux outils pour la modulation du système immunitaire

• Main Author: Achilli, Silvia
• Other Authors: Grenoble Alpes
• Language: en
• Published: 2018
• Subjects: Lectines de Type C; Criblage; Glycomimétisme; Multivalence; Avidité; C type Lectin; Screening; Glycomimetics; Multivalency; Avidity; 570
• Online Access: http://www.theses.fr/2018GREAV014/document

Les lectines de type C (CLRs) sont des récepteurs impliqués dans la reconnaissance d’oligosaccharides et principalement exprimés à la surface des cellules présentatrices d’antigène (APCs) et notamment des cellules dendritiques (DCs), véritable sentinelle de notre système immunitaire. Elles sont impliquées dans la reconnaissance de motifs spécifiques exprimés à la surface d’agents pathogènes et sont capables de stimuler le système immunitaire afin de déclencher une réponse adaptée. Ce rôle crucial joué par les CLRs dans l’équilibre de la réponse immunitaire confère aux interactions CLR/glycane des perspectives d’applications pharmaceutiques. L’objectif à long-terme du projet de recherche dans lequel cette thèse s’intègre consiste à utiliser ces CLRs pour modeler les réponses du système immunitaire. A cette fin, des néoglycoconjugués spécifiques de chaque CLR doivent être développés. Au cours de cette thèse, 9 CLRs ont été produits BDCA2, DC-SIGN, DC-SIGNR, dectin-1, dectin-2, langerin, LSECtin, MCL and Mincle. Différentes stratégies de production ont été testées en parallèle, incluant des techniques d’adressage au périplasme en vue d’obtenir des protéines solubles et fonctionnelles et de l’expression cytoplasmique, sous forme de corps d’inclusion suivie d’étapes de renaturation qui s’est révélé la plus efficace au final. Une stratégie permettant de construire des tétramères artificiels de CLRs, appelés TETRALEC, a été mise au point. Cet outil permettant le criblage et la caractérisation des lectines a été obtenu avec DC-SIGNR par un marquage spécifique de la lectine. Le complexe TETRALEC a été caractérisé au niveau structural et des tests fonctionnels ont été menés sur des puces à glycanes et des cellules pathogènes. La série de CLRs que nous avons produites a été utilisée pour cribler des puces à glycanes et à glycomimétiques. Ces études nous ont permis de mettre en évidence des interactions dépendantes de l’environnement du glycane et d’identifier de nouveaux glycanes ou glycomimétiques spécifiques de certains CLRs. En effet, de manière étonnante, plusieurs des CLRs testés sont capables, pour un glycane donné, de discriminer des isomères de position ouvrant ainsi de nouveaux questionnements sur la signification biologique de cette sélectivité. De plus des glycomimétiques reconnaissant préférentiellement dectin-2 par rapport à DC-SIGN, DCSIGNR et langerin ont été identifiés. Le choix des glycomimétiques et l’évaluation des étapes de leur optimisation ont été permis par diverses études biophysiques qui ont quantifié la force et la spécificité des interactions. Ceci a permis le développement d’un ligand optimisé sélectif de DC-SIGN. La co-cristallisation de la protéine avec ce ligand a révélé un intéressant mode de liaison qui amène également de nouvelles questions. Simultanément à l’optimisation de ligands monovalents, un premier pas a été réalisé vers la conception d’une molécule pour permettre une vaccination contre le cancer médiée par les CLRs. Les résultats de SPR ont identifié des candidats potentiellement intéressants et des tests biologiques préliminaires ont été réalisés. === C-type Lectin Receptors (CLRs) are carbohydrate-binding proteins mainly expressed on Antigen Presenting Cells (APCs), including dendritic Cells (DCs), the sentinel of the innate immune system. They recognize pathogens or damaged cells by interacting with glycan features and the encounter between the CLR and its ligand constitutes a necessary step for the activation of the adaptive immune system. This crucial role played by CLRs in the balance of immune responses offers to CLR-glycan interactions pharmaceutical applications. The long-term objective of the research project in which this PhD is included is to use these CLRs as modulators in order to tailor the immune system responses. To do so, neoglyco-conjugates selective to each individual CLR have to be developed.Nine different CLRs were produced in this work: BDCA2, DC-SIGN, DC-SIGNR, dectin-1, dectin-2, langerin, LSECtin, MCL and Mincle.Several approaches have been explored in parallel for CLR production, ranking from bacterial periplasmic targeting, aiming to express soluble and functional protein, to inclusion bodies production into the bacterial cytoplasm, with subsequent protein refolding. Our collection of CLRs were used to screen glycan and glycomimetic arrays, highlighting context-dependent binding and identifying natural ligands or glycomimetics selective to each CLRs. Thus, several CLRs were surprisingly able to differentiate between positional isomers of a given N-Glycan, which opens new questions regarding the biological significance. Moreover, glycomimetics with a selectivity towards dectin-2 over DC-SIGN, DC-SIGNR and langerin CLRs have been identified.To guide the choice of the glycomimetics and estimate their optimisation, diverse biophysical studies were performed to evaluate the strength and specificity of the interaction. This enabled the development of an ultimate ligand selective towards DC-SIGN. A co-crystallised structure of the protein with this ligand revealed an interesting binding mode that also opens new questions.Simultaneously to monovalent ligand optimization, a first step towards the design of a highly defined molecule for cancer vaccination by CLR targeting was made. SPR results revealed potential candidates to exploit and preliminary biological assays were performed. Finally, a strategy for tetrameric lectin engineering as been explored, termed TETRALEC. This tool for screening and lectin characterization, has been obtained with one the lectin of the study, DC-SIGNR, by a site-specific labelling of the lectin. The TETRALEC complex was structurally characterised and functional assays were performed on glycan array and pathogen cells.