| Summary: | La mucoviscidose est la maladie génétique autosomique récessive létale la plus fréquente dans la population caucasienne. Le gène muté code pour la protéine CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator). CFTR est un canal anionique localisé dans la membrane apicale des épithélia. Il permet notamment le transport d’ions chlorure (Cl-) et bicarbonates (HCO3-). La délétion de la phénylalanine en position 508 (F508del) de CFTR est la mutation la plus fréquente et entraîne un défaut d’adressage de CFTR à la membrane plasmique. L’atteinte respiratoire réalise une bronchopathie obstructive surinfectée qui détermine le pronostic vital de la maladie. Deux mécanismes délétères présents dès la période néonatale vont notamment contribuer à la destruction du tissu pulmonaire : une inflammation exacerbée et auto-entretenue, et une colonisation bactérienne chronique du mucus notamment à Pseudomonas aerugonisa et Staphylococcus aureus. Les mécanismes à l’origine de l'initiation de ce double processus demeurent inconnus. De plus en plus d'arguments plaident pour l'implication des ions HCO3-, donc du pH, dans l'initiation de l'atteinte pulmonaire de la mucoviscidose. En effet, le défaut de CFTR entraîne une diminution de leur sécrétion dans le liquide de surface bronchique (ou Airway Surface Liquid : ASL), ce qui conduit à un pH local anormalement bas. Les ions HCO3- jouent un rôle important dans la physiopathologie bronchique pulmonaire. En effet, ils régulent la rhéologie du mucus et sont impliqués dans l’activité des peptides antimicrobiens, principaux facteurs de la bactéricidie locale et dont l'activité est pH dépendante. Cela a été démontré dans un modèle porcin de mucoviscidose. Ainsi une altération du transport de HCO3- pourrait contribuer à l'hyperviscosité des sécrétions muqueuses, initier la colonisation bactérienne en diminuant le pouvoir bactéricide du liquide de surface respiratoire. Cette hypothèse est la base de mon projet visant à étudier le rôle du transport transépithélial des ions bicarbonates dans la bactéricidie au sein de l’épithélium respiratoire dans la mucoviscidose. La mesure du pH de l’ASL a nécessité la conception d’une enceinte à atmosphère contrôlée. Cet outil a permis la mise en évidence d’une acidité de l’ASL F508del en comparaison du Wild Type (WT), due à un défaut de sécrétion des ions HCO3- dans l’ASL, lui-même induit par une inhibition fonctionnelle du transporteur Cl-/HCO3- SLC26A4 ou pendrine majoritairement et du canal CFTR minoritairement. L’évaluation de la bactéricidie de l’ASL après infection au Staphylococcus aureus révèle une déficience de bactéricidie chez les cellules épithéliales F508del, reliée à l’activité anormale de la pendrine. L’investigation des capacités d’adhésion et d’invasion du Staphylococcus aureus dans nos modèles montre que le défaut de bactéricidie épithélial observé se restreint à l’ASL et incite à poursuivre les recherches sur le rôle du pH de l’ASL dans l’activité de ses peptides antimicrobiens, principale ligne de défense de l’immunité innée respiratoire. Notre travail de restauration du pH de l’ASL avant infection de l’épithélium respiratoire démontre d’ores et déjà l’impact significatif du pH de l’ASL dans la modulation de sa bactéricidie, où la restauration du pH est corrélée à une amélioration de la bactéricidie. Ce travail met en lumière le rôle crucial du pH de l’ASL dans l’appréhension de la physiopathologie de la maladie et sensibilise à de nouvelles voies thérapeutiques, basées sur une restauration du pH de l’ASL et/ou l’utilisation de peptides antimicrobiens pH-indépendant. === Cystic fibrosis (CF) is a lethal autosomal recessive disorder caused by mutations in the CF Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) gene encoding for a cAMP-activated anionic channel, secreting mainly chloride (Cl-) and bicarbonate (HCO3-) at the apical surface of the epithelia. Most patients are homozygous for the p.PHe508del mutation (F508del). The main cause of morbidity and mortality is obstructive lung disease characterized by exacerbated inflammation and bacterial infection of the airway surface liquid (ASL), a thin layer coating the luminal face of the airway epithelium. ASL bacterial colonization begins from the first hours of life with evidence of Staphylococcus aureus in airway secretions pointing to impaired local defense. However, the defect responsible for this defective bacterial clearance is not clearly understood. It was proposed to be related to decreased mucociliary clearance and abnormal inflammatory responses, but recent studies also show the contribution of ASL in the reduced antimicrobial capacity of ASL in CF airways. An abnormally low ASL pH impairs mucin hydration and solubilization, resulting in hyperviscous mucus, which impedes muco-ciliary clearance. It also reduces the activity of antimicrobial peptides by modulating their native charges and the bactericidal activity of antibiotics. This was supported by studies in newborn CF pigs, which highlighted an abnormally low ASL pH, in association with a defective short-term S. aureus antimicrobial activity. Restoring normal pH in the ASL of CF pigs improved ability to eradicate the bacteria, showing that reduced ASL pH is central to disease pathogenesis. However, there is still controversy about the value of ASL pH in humans. Very recently, a study in young CF children, based on in vivo measurements, showed similar ASL pH values in children with CF to that in children without CF. The mechanisms underlying the ASL pH homeostasis and in particular the balance between HCO3- and proton (H+) secretion are still not known. Shah et al highlighted the role of persistent H+ secretion by ATP12A concomitant to a CFTR-mediated reduced bicarbonate transport, but recent work overexpressing ATP12A in respiratory cells failed to find any pH modification in physiological conditions. Most importantly, there is no clear understanding of the initial host response, when S. aureus bacteria land on the pristine surface of a newborn airway, with a prolonged time of contact and continuous reseeding from infected mucus plugs. This is however crucial to clarify pathogenesis of this early steps to counteract pro-infectious vicious circle and define optimal therapeutic strategy in newborns. We focused on human airways and hypothesized that S. aureus clearance during the first hours of infection was impaired in human airway CF ASL because of lowered ASL pH. To test this hypothesis, we designed bacterial infection experiments within human airway epithelium to mirror the onset of initial S. aureus infection. We then studied the relationship between local bacterial clearance and ASL pH regulation in WT and F508del homozygous human bronchial epithelial cells, with special emphasis on physiologically relevant HCO3- and H+ transporters.
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