| Summary: | L'objectif principal de mon projet de doctorat est d'étudier l'évolution génomique de l'ordre des Archaea Thermococcales. Je me suis intéressé à comprendre les mécanismes des éléments mobiles génétiques (MGE) pouvant influencer l'évolution des génomes. En utilisant une approche multidisciplinaire, nous avons pu explorer les différents aspects de ce phénomène in silico, in vitro et in vivo. Grâce à des analyses in silico de tous les génomes de Thermococcales complètement séquencés disponibles, nous avons montré que cet ordre affiche un niveau élevé de réarrangements pouvant perturber les modèles d'expression génique. Dans une première approche, nous avons étudié l'existence de l'organisation chromosomique. L'inefficacité dans la prédiction de l'origine et de la terminaison de la réplication sur la seule base de la composition de l'ADN chromosomique ou skew, nous a motivé à utiliser une approche différente basée sur des séquences biologiquement pertinentes. Nous avons donc déterminé la position de l'origine de la réplication (oriC) dans tous les 21 génomes séquencés Thermococcales. La position potentielle de la terminaison a été prédite dans 19 génomes à ou près du site dif, où les dimères chromosomiques sont résolus avant la ségrégation de l'ADN. Le calcul du génome central a révélé un certain nombre de grappes de gènes essentiels avec une position chromosomique remarquablement stable à travers les espèces, en utilisant oriC comme référence. D'autre part, les régions core-free semblent correspondre à des éléments mobiles intégrés putatifs. Ces observations indiquent qu'un degré remarquable d ' «ordre» a été maintenu à travers les Thermococcales, même s'ils présentent des chromosomes fortement brouillés, les inversions étant particulièrement fréquentes. La découverte et la caractérisation d'un nouvel organisme, Thermococcus nautili nous ont permis de mieux comprendre le mécanisme sous-jacent causant ces inversions. En effet, le séquençage et l'analyse in silico de son génome ont fortement suggéré l'implication d'une nouvelle classe de tyrosine recombinases dans la plasticité génomique. Le plasmide pTN3 de T. nautili, qui est intégré dans le chromosome et auto-réplicable, code une intégrase appartenant à la classe des tyrosine recombinases. Des plasmides similaires ont également été trouvés intégrés dans le chromosome d'autres séquences de Thermococcales (par exemple TKV4 dans T. kodakarensis). Afin de tester son activité enzymatique, l’integrase codée par le plasmide pTN3 a été surproduite et purifiée. Les expériences in vitro ont d'abord permis de déterminer le segment de séquence minimal requis pour l'activité de l'intégrase et optimisé la réaction enzymatique in vitro. Ces résultats nous ont permis, en suite, de démontrer la réaction d'excision / d'intégration observée avec d'autres recombinases de tyrosine. De plus, l'excision in vivo d'un élément intégré apparenté (TKV4 de T. kodakarensis) par l'intégrase pTN3 a été réalisée au cours de cette étude. Pour cela, le gène IntpTN3 a été clone dans un vecteur de la bactérie E. coli / Thermococcus pour la transformation et l'expression dans T. kodakarensis. Après incubation, les cellules ont montré la présence de l'élément TKV4-intégré dans la forme circulaire libre. Enfin, nous avons pu imiter l'inversion chromosomique in vitro en utilisant des substrats synthétiques contenant des séquences cibles d'intégration. Nous avons également pu montrer que l'intégrase pTN3 possède une activité qui peut intervenir sur des inversions génomiques à grande échelle en utilisant différents sites et donc expliquer les réarrangements observés dans Thermococcales (Cossu et al, in prep). === The main goal of my PhD project is to investigate the genomic evolution of the Archaea Thermococcales order. I am interested in understanding how mobile genetic elements (MGE) can influence the evolution of genomes. Using a multidisciplinary approach, we were able to explore the different aspects of this phenomenon in silico, in vitro and in vivo. Through in silico analyses of all available completely sequenced Thermococcales genomes, we showed that this order displays a characteristic high level of rearrangements potentially disrupting gene expression patterns. In a first approach, we investigated the existence of chromosomal organization. The inefficiency in predicting origin and termination of replication on the sole basis of chromosomal DNA composition or skew, motivated us to use a different approach based on biologically relevant sequences. We determined the position of the origin of replication (oriC) in all 21 sequenced Thermococcales genomes. The potential position of the termination was predicted in 19 genomes at or near the dif site, where chromosome dimers are resolved before DNA segregation. Computation of the core genome uncovered a number of essential gene clusters with a remarkably stable chromosomal position across species, using oriC as reference. On the other hand, core-free regions appear to correspond to putative integrated mobile elements. These observations indicate that a remarkable degree of “order” has been maintained across Thermococcales even if they display highly scrambled chromosomes, with inversions being especially frequent. The discovery and characterization of a new organism, Thermococcus nautili allowed us to better understand the underlying mechanism causing these inversions. The sequencing and in silico analysis of its genome strongly suggested the involvement of a new class of tyrosine recombinases in genomic plasticity. T. nautili pTN3 plasmid, which is found integrated into the chromosome and also self-replicating encodes an integrase belonging to this class. Similar plasmids have also been found integrated in the chromosome of other sequenced Thermococcales (e.g. TKV4 in T. kodakarensis). In order to test its enzymatic activity, we overproduced and purified the integrase encoded by pTN3. In vitro experiments first determined the minimal sequence segment required for integrase activity and optimized the enzymatic reaction in vitro. Due to this early results, we were able to demonstrate the excision/integration reaction observed with other tyrosine recombinases. Additionally, the in vivo excision of a related integrated element (TKV4 from T. kodakarensis) by the pTN3 integrase was performed during this study. The IntpTN3 gene has been cloned into an E. coli/Thermococcus shuttle vector for transformation and expression in T. kodakarensis. After incubation, cells showed the presence of the TKV4-integrated element in free circular form. Finally, we were able to mimic in vitro chromosomal inversion using synthetic substrates containing integration target sequences. We were also able to show that pTN3 integrase possesses an activity which can mediate large scale genomic inversions using different sites and therefore explain the rearrangements observed in Thermococcales).
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