Optimization of enzymes via directed evolution in vivo

• Main Author: Souterre, Tiffany
• Other Authors: Université Paris-Saclay (ComUE)
• Language: en
• Published: 2017
• Subjects: Dioxygénases; GM3; (α-KAO); Evolution dirigée
• Online Access: http://www.theses.fr/2017SACLE016/document

De nombreuses méthodes in vitro d’évolution d'enzymes existent mais elles sont souvent coûteuses en temps et en main d'œuvre. Une approche alternative, l’évolution dirigée in vivo, permet la sélection de variantes d'enzymes améliorées ou modifiées à moindre coût et peut être appliquée à des enzymes de structure inconnue. Des dispositifs automatisés de culture continue (GM3), ont été développés et construits au Genoscope. Le GM3 a été conçu pour maintenir indéfiniment des cultures bactériennes en suspension tout en les soumettant à des régimes de culture sélectifs de type turbidostat et chémostat. Le principal objectif du présent travail était l’optimisation par évolution dirigée in vivo d’enzymes de la famille des dioxygénases à α-cétoglutarate et fer-dépendantes (α-KAO). Les α-KAOs catalysent l'hydroxylation d’un atome de carbone non substitué et sont donc d’intéressants outils pour la fonctionnalisation de molécules en synthèse organique. La dynamique de fixation d’une mutation bénéfique dans une population en croissance en fonction du régime de culture et du format d’expression a été étudiée. Des souches d’Escherichia coli ont été génétiquement modifiées pour que leur croissance dépende strictement d’une activité α-KAO. Des populations de ces bactéries exprimant une α-KAO ont été soumises à des protocoles d’évolution dirigée in vivo pour sélectionner: dans un premier temps, des variants d’expression optimisée sur le substrat naturel de l’enzyme, dans un second temps, des variants utilisant des analogues de substrat non naturels. Deux variantes de la L-isoleucine dioxygénase (E65K, A62P) ont été obtenues. L’étude des paramètres cinétiques déterminera l’effet de ces mutations sur l’activité de l’enzyme. En collaboration avec l’équipe du Dr. Tolonen, la culture continue a été appliquée à l’évolution de la bactérie cellulolytique Clostridium phytofermentans. Cette bactérie anaérobie stricte qui dégrade la lignocellulose en éthanol et H2 présente un intérêt applicatif pour la valorisation de la biomasse. La dégradation de la lignocellulose libère des composés phénoliques, en particulier l’acide férulique. C. phytofermentans a été adapté à résister à des concentrations croissantes de ce composé inhibiteur. Des isolats résistant au ferulate ont été analysés et leur génomes séquencés (Cerisy et al., 2017). === Numerous methods of directed evolution in vitro have been developed. These methods are often expensive and time-consuming. An alternative approach, directed evolution in vivo, allows the selection of protein variants at lower cost and does not require prior knowledge of the protein’s structure and mechanism. An automated continuous culture device, the GM3, has been developed and built at the Genoscope. The GM3 technology enables the maintenance of steady-state microbial growth over an extended period of time.The main objective of the present study was the optimization by directed evolution in vivo of enzymes of the family of the Iron(II)/α-ketoacid-dependent oxygenases (α-KAOs). The α-KAOs catalyze the hydroxylation of non-activated C-H bonds and thus are interesting tools for the functionalization of organic molecules in synthetic chemistry.The dynamics of fixation of beneficial mutations in a growing cell population depending on the expression format and the culture regime has been explored.Strains of Escherichia coli have been genetically modified such that their growth strictly depended on a α-KAO activity. Populations of these bacteria expressing a α-KAO were subjected to protocols of directed evolution in continuous culture in order to select, in a first round, variants showing optimized expression on natural substrates of the enzyme, and in a second round, variants with activity towards non-natural analogs of the substrate. Two variants of L-isoleucine dioxygenase (E65K, A62P) were obtained. The determination of the kinetic parameters will reveal the influence of these mutations on the activity of the enzyme variants.In collaboration with the group of Dr. Tolonen, directed evolution in continuous culture was applied to the cellulolytic bacteria Clostridium phytofermentans. This anaerobic bacterium degrades lignocellulose into ethanol and H2 and can thus be applied for biomass valorization. The degradation of lignocellulose liberates phenolic compounds like ferulic acid known to be toxic to the bacteria. C. phytofermentans was adapted in the GM3 to resist to growing concentrations of this inhibitor. Resistant bacteria were analyzed and their genomes sequenced (Cerisy et al., 2017).