Real-time unfolding of DNA G-quadruplexes by helicases and polymerases

• Main Author: Hodeib, Samar
• Other Authors: Paris Sciences et Lettres
• Language: en
• Published: 2017
• Subjects: G-Quadruplex; Hélicase; Polymérase; Pinces magnétiques; ADN; Réplication; Helicase; Polymerase; Magnetic tweezers; DNA; Replication; 571.41; 571.42
• Online Access: http://www.theses.fr/2017PSLEE027/document

Les structures G-quadruplexes (G4) sont considérées comme des obstacles qui s’opposent à la progression du réplisome. Les séquences capables de former des G4 dans le génome humain se trouvent dans les régions d’ADN double brin au niveau des oncogènes et des proto-oncongènes et sur l’extrémité simple brin des télomères. La plupart des études biochimiques et biophysiques ont caractérisé les propriétés thermodynamiques des G4 en utilisant par exemple la température de fusion Tm pour déduire la thermodynamique de la formation/résolution du G4. Cependant, les expériences en solution donnent seulement une information indirecte concernant la dynamique du G4. Dans ce travail de thèse en molécule unique utilisant la technique des pinces magnétiques, nous avons pu caractériser la cinétique de la formation et résolution des G4s ainsi que la stabilité d’une structure G4 insérée dans une région d’ADN double brin : une situation qui ressemble aux G4 dans les promoteurs de gènes, où la séquence complémentaire est en compétition avec la formation de la structure de G4. Nous avons trouvé que le G4 télomérique a une très courte durée de vie (~20 s) et donc ce G4 se résout sans qu’une hélicase soit nécessaire. Au contraire, ce n’est pas le cas pour le G4 du c-MYC qui est très stable (~2h). Nous avons observé en temps réel la collision entre les hélicases et les polymérases et le G4 du c-MYC. Nous avons trouvé que l’hélicase Pif1 ouvre l’ADN puis résout le G4 après avoir effectué une pause et reprend l’ouverture de l’ADN, alors que l’hélicase RecQ et l’hélicase réplicative du bactériophage T4 ne peuvent pas le résoudre, mais peuvent le sauter. Nous avons aussi trouvé que la RPA ne peut pas résoudre le G4 du c-MYC. D’autre part, nous avons observé que la polyémrase du virus T4, la gp43, ainsi que la polymérase de T7, et la polymérase ε de la levure peuvent répliquer le G4 du c-MYC qui de façon étonnante ne constitue pas une barrière infranchissable. === G-quadruplex (G4) structures are considered as the major impediments for the replisome progression. The putative G4 forming sequences in the human genome are mostly located in the double-stranded DNA regions of oncogenes and proto-oncogenes and on the single-stranded overhangs of telomeres. Most of the biochemical and biophysical studies have characterized the G4 thermodynamics properties using melting temperature Tm as a proxy to infer thermodynamics of G4 folding/unfolding energetic. However, these thermodynamics properties give only indirect information about G4 dynamics. In this work, using single molecule magnetic tweezers technique, we first characterize the kinetics of folding and unfolding and thus the stability of a single G4 inserted in a dsDNA: a situation that mimics the G4s in promoters, where the complementary sequence competes with the G-rich structure. We find that the lifetime of telomeric G4 is short (~20 s) and thus that this G4 unfolds without the need of a helicase. This is not the case for the very stable c-MYC G4 (~2 hr). We observe in real time how helicases or polymerases behave as they collide with the c-MYC G4 on their track. We find that the Pif1 helicase unwinds dsDNA, resolves this G4 after pausing and resume unwinding, while RecQ helicase and the bacteriophage T4 replicative helicase do not resolve the G4 but may jump it. We also find that RPA does not unfold the c-MYC G4. Besides, we find that T4 bacteriophage gp43 polymerase, T7 polymerase and Yeast Pol ε can replicate the G4 which surprisingly does not appear as a major roadblock for them.