Impact des modifications post-traductionnelles sur la dynamique du cytosquelette

• Main Author: Larbret, Frédéric
• Other Authors: Côte d'Azur
• Language: fr
• Published: 2017
• Subjects: Cytosquelette; FRET; Cytométrie en flux; Criblage; PTMs; Cytoskeleton; Flow cytometry; Screening
• Online Access: http://www.theses.fr/2017AZUR4044

Le cytosquelette représente un élément crucial dans les processus cellulaires essentiels des cellules lymphoïdes. Les différents filaments du cytosquelette et leurs modes de régulation représentent donc des cibles thérapeutiques majeures pour le développement de nouveaux composés pharmacologiques. Au cours de ce travail de thèse, nous avons mis au point une nouvelle méthode d’analyse par cytométrie en flux (CytoFRET) permettant de visualiser simultanément la dynamique de polymérisation des filaments d’actine, des microtubules et des filaments intermédiaires de vimentine dans la lignée leucémique T Jurkat. Cette méthode a été utilisée pour le criblage d’une mini-chimiothèque composée d’inhibiteurs d’enzymes impliquées dans les modifications post-traductionnelles des protéines. Nous avons ainsi identifié deux composés, le WP1130 et le b-AP15, des inhibiteurs d’enzymes de déubiquitination (DUBs), comme puissants inducteurs de la polymérisation/nucléation de l’actine. Nous avons montré que l’effet de ces inhibiteurs sur les microfilaments d’actine est consécutif à une poly-ubiquitination de la Destrine, une protéine de liaison à l’actine. Nous avons également identifié des inhibiteurs des déacétylases HDAC6 et SIRT2 comme inducteurs de la polymérisation des microtubules et de l’assemblage de la vimentine. L’effet de ces inhibiteurs a été corrélé à une acétylation directe de la tubuline mais pas de la vimentine. Ces résultats ouvrent ainsi de nouvelles perspectives à la fois fondamentale et thérapeutique sur la physiopathologie du cytosquelette des cellules lymphoïdes. === Actin, microtubules, and intermediate filaments compose three major cytoskeletal structures of vertebrate cells that are characterized by highly dynamic balances between assembly and de-assembly, underlying critical cellular processes such as mitosis, architecture and movement. Consequently, cytoskeleton dysfunctions have been implicated in several pathological situations including cell transformation and metastasis. Thus, cytoskeletal networks represent major targets for the development of novel anti-cancer and anti-metastatic therapies. However, drug development is currently limited by the availability of high-throughput screening systems allowing the simultaneous monitoring of actin, microtubules and intermediate filaments dynamics in living cells. In this work, we have developed a novel screening assay of cytoskeleton dynamics based on the simultaneous recording by flow cytometry of FRET signals produced by the variation of actin, tubulin and vimentin filaments dynamics in living cells. Our novel method was employed to screen a mini-library of drugs known for their ability to interfere with post-translationnal modifications of proteins. Interestingly, our approach revealed that compounds interfering with lysine acetylation have a dramatic impact on vimentin filaments assembly and microtubules polymerization. In addition, two inhibitors (WP1130 and b-AP15) of deubiquitinating enzymes showed increase of actin polymerization. This effect was attributed to poly-ubiquitnation of Destrin, an actin binding protein. In conclusion, our FRET multiplex flow cytometry assay represents a novel effective method for the future development of new anti-cancer therapies.