| Summary: | L’objectif de ce travail était le développement d’une lipase gastrique pour des modèles de digestion in vitro reproduisant les conditions physiologiques du tractus digestif. Nous avons produit, caractérisé et mis en oeuvre un extrait d’estomacs de lapin contenant la lipase gastrique et la pepsine. Cet extrait, a permis de simuler le potentiel enzymatique du suc gastrique lors de digestions in vitro. La digestion d’émulsions d’huile de colza-β-caséine a permis d’appréhender l’impact des lipides et de la lipolyse sur la protéolyse de la β-caséine.Une lipase gastrique humaine recombinante (rHGL) a également été produite chez la levure Pichia pastoris grâce à un vecteur d’expression constitutive contenant le peptide de sécrétion α. Cette production a nécessité l’optimisation des conditions de pH pour éviter la dégradation de la protéine sécrétée, active et glycosylée. Une fraction importante de la rHGL sécrétée étant accrochée à la paroi des levures, un protocole de purification incluant une étape de décrochage a été développé en jouant de nouveau sur le pH. La rHGL purifiée a été caractérisée en fonction du pH, de divers substrats et de la présence de sels biliaires, et ses propriétés sont proches de celles de la HGL native. Nous avons ensuite étudié par mutagénèse dirigée le rôle de résidus (K4, E225, R229) impliqués dans des ponts salins stabilisant le volet de la rHGL dans sa conformation ouverte. Ce volet contrôle l’accès au site actif de la lipase et participe au site de reconnaissance interfaciale. La mutation de ces résidus modifie l’activité en fonction du pH de la rHGL et suggère qu’ils jouent un rôle important dans l’activité optimale de la HGL à pH acide. === The aim of this work was the development of a gastric lipase for in vitro digestion models reproducing the physiological conditions of the digestive tract.We produced, characterized and implemented an extract of rabbit stomachs containing gastric lipase and pepsin. This extract was further used to simulate the enzymatic potential of the gastric juice during in vitro digestion assays. The digestion of rapeseed oil-β-casein emulsions allowed investigating the impact of lipids and lipolysis on the proteolysis of β-casein.A recombinant human gastric lipase (rHGL) was also produced in the yeast Pichia pastoris using a constitutive expression vector containing the α secretion peptide. This production required the optimization of pH conditions to avoid degradation of the secreted, active and glycosylated protein. A large fraction of the secreted rHGL remaining bound to the yeast cell wall, a purification protocol including a release step was developed by shifting the pH. The purified rHGL was characterized as a function of pH, various substrates and the presence of bile salts, and its properties were found to be similar to those of native HGL. We then studied by site-directed mutagenesis the role of residues (K4, E225, R229) involved in salt bridges stabilizing the rHGL lid in its open conformation. This lid controls the access to the lipase active site and is involved in the interfacial recognition site. The mutation of these residues modifies the activity of rHGL as a function of pH and suggests that these amino acid residues play an important role in the optimum activity of HGL at acid pH.
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