Biochips based on silicon for detecting the interaction between aptamers and pathogens

• Main Author: Aschl, Timothy
• Other Authors: Université Paris-Saclay (ComUE)
• Language: en
• Published: 2016
• Subjects: Biopuce; Aptamère; Pathogène; Ochratoxine A; Hydrosilylation; Biochip; Aptamer; Pathogen; Ochratoxin A
• Online Access: http://www.theses.fr/2016SACLX103/document

La détection rapide et sensible des agents pathogènes est d’une très grande importance pour la biosécurité. Les biopuces sont bien adaptées à cet effet, car elles permettent la détection multiplexe des cibles. Une limitation cruciale des biopuces est leur manque de fiabilité et de sensibilité. L’objectif de cette thèse est de développer une architecture reproductible de biopuces à base de couche mince de silicium amorphe carboné (a-SiC:H) déposée sur un réflecteur en aluminium pour une détection fiable et sensible des pathogènes. Nous avons choisi comme système modèle l’interaction de la toxine alimentaire ochratoxine A (OTA) avec son aptamère AntiOTA de longueur 36mer. Les aptamères (simples brins d’ADN) sont de plus en plus utilisés comme sondes en raison de leur grande spécificité et affinité vis-à-vis d’une large gamme de cibles (i.e. protéines, bactéries…). La stratégie de fabrication consiste en un greffage de monocouches organiques d’acides carboxyliques via des liaisons Si-C robustes, suivi de l’accrochage covalent des aptamères par un couplage peptidique. Les processus de greffage ont été mis au point sur silicium cristallin permettant la quantification des couches greffées par spectroscopie infrarouge en mode ATR (Attenuated total reflexion). La quantification IR des interactions OTA – AntiOTA a été montrée pour la première fois sur des surfaces par IR-ATR. La spécificité de l’aptamère a été démontrée en utilisant une molécule chimiquement similaire (warfarin), pour laquelle l’AntiOTA ne montre aucune affinité. Ces protocoles bien contrôlés ont été transférés sur l’architecture de la biopuce a-SiC:H. Les aptamères immobilisés sont hybridés avec des brins complémentaires marqués avec des fluorophores. En présence de l’OTA une déshybridation des brins complémentaires est attendue, conduisant à une diminution du signal fluorescent. Différentes longueurs de brins complémentaires ont été comparées, montrant jusqu’à 13% de diminution due à l’interaction de l’OTA. === Rapid and sensitive detection of pathogenic targets play a crucial role in biosecurity. Biochips are ideal for this, as they allow easy and multiplex detection of targets. A crucial limitation in biochips is that they often suffer from low reliability and sensitivity. The goal of this thesis is to develop a stable and reproducible architecture for biochips based on an amorphous silicon carbon alloy (a-SiC:H) deposited on an aluminium back-reflector for reliable and sensitive detection of pathogens. On these biochips we introduced the interaction of the food and feed toxin ochratoxin A (OTA) with its 36mer aptamer AntiOTA as a model system. Aptamers (single strands of DNA) are ideal as probes for biochips as they display high specificity and affinity towards a wide range of targets (i.e. proteins, bacteria…). The well-controlled multi-step fabrication process consists of the reliable photochemical grafting of acid-terminated organic monolayers on silicon surfaces by robust Si C bonds, which in turn were functionalized with aptamers by stable peptide coupling. Carrying out this process on crystalline silicon allowed monitoring and quantification of every step by infrared spectroscopy (IR-ATR). The interaction OTA – AntiOTA was shown for the first time on surfaces by IR, and an IR in situ calibration allowed the quantification of OTA which was bound by the aptamers on the surface. The specificity of AntiOTA towards OTA was demonstrated by using a chemically similar molecule (warfarin), for which AntiOTA shows no affinity. The well-controlled protocols were transferred to the a-SiC:H biochip. The immobilized aptamers were hybridized with complementary and fluorescent-labeled DNA-strands. In presence of OTA, dehybridization of the complementary strands is expected, resulting in a decrease of fluorescent signal. Different lengths of complementary strands were compared, exhibiting up to 13% signal decrease due to OTA.