Towards genome-wide, single-molecule analysis of eukaryotic DNA replication

• Main Author: De Carli, Francesco
• Other Authors: Paris 6
• Language: en
• Published: 2016
• Subjects: Réplication de l'ADN; Peignage moléculaire; Code-Barre fluorescent; Molécule unique; Nanocanaux; Épifluorescence; DNA replication; Single-molecule; Nanochannels; 572.86
• Online Access: http://www.theses.fr/2016PA066600/document

Chez les eucaryotes, la réplication de l'ADN démarre au niveau de multiples origines activées suivant un programme précis, qui peut être analysé à l'échelle du génome sur des populations cellulaires. Cependant, l'étude de la variabilité intercellulaire, la détection d'évènements rares et la mesure de la vitesse des fourches de réplication nécessitent des analyses en molécule unique. Avec les techniques actuelles, l'ADN néosynthétisé est marqué avec des analogues de la thymidine et révélé par des anticorps fluorescents. Les molécules d'intérêt sont identifiées par hybridation fluorescente in situ. Ces étapes sont complexes et le débit est faible. Cette thèse développe de nouvelles méthodes de détection et d'identification des molécules d'ADN réplicatives sans anticorps et à haut débit. L'ADN est répliqué en présence d'un dUTP fluorescent, purifié puis marqué en code-barre spécifique permettant l'alignement sur le génome de référence par coupure avec une endonucléase simple brin et incorporation d'un autre dUTP fluorescent. L'ADN est ensuite coloré avec un intercalant fluorescent, le YOYO-1. Les molécules d'ADN, leurs segments néorépliqués et leurs code-barres sont observés en trois couleurs différentes par épifluorescence directe. Les segments répliqués ont une fluorescence YOYO-1 plus intense, ce qui permet de détecter les bulles de réplication sans marquage métabolique. Ces outils ont été couplés à un dispositif nanofluidique dans lequel l'ADN est conduit dans des milliers de nanocanaux et imagé automatiquement, ce qui augmente massivement le débit. L'ensemble de ces résultats ouvre la voie à la cartographie pangénomique de la réplication de l'ADN en molécule unique. === In eukaryotes, DNA replication starts at multiple origins that are activated following a specific program. Population methods allow genome-wide analysis of DNA replication. However, single-molecule methods are required to monitor cell-to-cell variability, detect rare events and measure individual replication fork speeds. With the existing techniques, newly-synthesized DNA is labelled with thymidine analogs and revealed with fluorescent antibodies. Fibres containing a locus of interest can be identified by fluorescent in situ hybridization. These steps are complex and the throughput is low. This work proposes novel, antibody-free tools to detect replication tracts and identify the locus of origin of all DNA molecules at much higher throughput. DNA replicated in the presence of a fluorescent dUTP was purified and specifically barcoded by using a nicking endonuclease, followed by limited nick-translation with another fluorescent dUTP. This allowed alignment to a reference genome map. DNA was then stained with the fluorescent DNA intercalator YOYO-1. Direct epifluorescence revealed the DNA molecules, their replication tracts and their barcodes in three distinct colours. Replicated segments showed a stronger YOYO-1 fluorescence, demonstrating that replication bubbles can be directly detected without metabolic labelling. Finally, these tools were coupled to a nanofluidic device: DNA was driven into 13,000 parallel nanochannels and automatically imaged, massively increasing the throughput. Altogether, these results provide a starting point for genome-wide, single-molecule mapping of DNA replication in eukaryotic organisms.