Diversité génétique et phénotypique d'une collection de souches de Streptococcus salivarius : étude des éléments intégratifs et des capacités d’adhésion aux cellules des écosystèmes digestif et buccal

• Main Author: Chaffanel, Fanny
• Other Authors: Université de Lorraine
• Language: fr
• Published: 2016
• Subjects: Streptococcus salivarius; Éléments intégratifs; ICE; IME; Adhésion cellulaire; Diversité des souches; 571.293; 572.869
• Online Access: http://www.theses.fr/2016LORR0070/document

Streptococcus salivarius est une bactérie commensale présente dans la cavité buccale et tout au long du tractus digestif (Eckburg et al., 2005; Hao & Lee, 2004). Elle est fréquemment retrouvée attachée à la langue ou aux parois stomacales et intestinales au sein de biofilms (Cvitkovitch et al., 2003). Dans un biofilm, la densité cellulaire implique une proximité physique entre les bactéries de différentes espèces propice aux échanges de gènes entre elles. Ces transferts horizontaux permettent l’acquisition par les bactéries de gènes d’adaptation tels que des gènes de résistance aux antibiotiques et de virulence (Kolenbrander et al., 2010; Molin & Tolker-Nielsen, 2003). Largement répandus dans les génomes bactériens, bien que peu étudiés, les éléments intégratifs conjugatifs (ICE) et les éléments intégratifs mobilisables (IME) jouent probablement un rôle majeur dans ces transferts et dans l’adaptation des souches à leur environnement. L’objectif de ce travail de thèse est d’étudier chez S. salivarius les éléments intégratifs (prévalence, diversité et transfert d’un ICE) ainsi que les capacités d’adhésion aux cellules des écosystèmes digestif et buccal. Une étude par MLST (MultiLocus Sequence Type) a permis de classer 212 souches de la collection de S. salivarius du laboratoire DynAMic en 96 Sequence Types et de révéler la diversité de ces souches. Parmi celles-ci, 138 ont été sélectionnées comme représentatives de la diversité de la collection pour les études ultérieures. La recherche par PCR d’éléments intégratifs parmi ces souches a permis de montrer que plus de 70% d'entre elles présentent au moins un élément intégratif porteur d’au moins un gène de résistance aux antibiotiques. Ainsi la diversité des phénotypes de résistance aux antibiotiques observée a pu être corrélée à la diversité des éléments intégratifs retrouvés (Tn916, Tn3872, Tn6002, Tn2009, MEGA) ou décrits pour la première fois (IQ element) chez S. salivarius. La diversité et la prévalence des ICE et des IME chez S. salivarius a été caractérisée au sein des génomes entièrement séquencés de 19 souches. Cette analyse a permis de détecter 27 ICE appartenant à 2 superfamilles (Tn916 et Tn5252) et 4 familles distinctes (ICESt3, Tn916, Tn1549 et TnGBS2) qui sont intégrés dans 12 sites d’intégration différents. Elle a également permis de détecter 37 IME qui sont intégrés dans 7 sites différents ainsi que 10 éléments MEGA intégrés dans deux gènes différents. L’étude des ICE de la famille ICESt3 qui sont décrits pour la première fois chez S. salivarius dans ce travail montre qu’ils sont intégrés dans le site déjà décrit (à l’extrémité 3’ du gène fda), mais aussi dans deux nouveaux sites (à l’extrémité 3’ des gènes rpsI et rpmG). En parallèle de ces travaux, la capacité d’adhésion de souches de S. salivarius à la salive et aux cellules épithéliales gastro-intestinales a été étudiée. Les résultats ont montré que la capacité d’adhésion à la salive de 24 souches est très variée et souche dépendante. De même, la capacité d’adhésion aux cellules épithéliales gastro-intestinales Caco2 et HT29-MTX de 14 de ces souches est souche dépendante mais aussi lignée cellulaire dépendante. Ces résultats ont permis de sélectionner la souche F6-1 dont le phénotype d’adhésion aux cellules HT29-MTX et HT29-CL16E est particulièrement élevé et dépendant de la sécrétion de mucus. L’étude de mutants de cette souche a montré que sa capacité d’adhésion dépend à la fois de certaines de ses protéines de surface et de la lignée cellulaire épithéliale gastro-intestinale. Enfin, des expériences de transfert conjugatif d’ICESt3 F6-1 rpsI ont été réalisées dans différentes conditions. Cependant, bien que sa capacité d’excision ait été démontrée et qu’une analyse in silico indique que cet ICE serait fonctionnel, aucun transconjugant n’a pu être obtenu dans les différentes conditions testées === Streptococcus salivarius is a commensal bacterium present in the oral cavity and all along the digestive tract (Eckburg et al., 2005; Hao & Lee, 2004). It is frequently found attached to tongue or to stomach and intestinal walls within biofilms (Cvitkovitch et al., 2003). In a biofilm, the cellular density implies a physical proximity between bacteria of different species which is favorable for genetic exchange between them. These horizontal transfers permit the bacteria to acquire genes of adaptation such as virulence and antibiotic resistance genes (Kolenbrander et al., 2010; Molin & Tolker-Nielsen, 2003). Largely present in the bacterial genomes, although not widely studied, the integrative conjugative elements (ICEs) and the integrative mobilizable elements (IMEs) probably play a major role in these transfers and in the adaptation of strains to their environment. The objective of this thesis is to study within S. salivarius the integrative elements (prevalence, diversity and transfer of one ICE) as well as the adhesion capacity to the cells of the oral and digestive ecosystems. A MLST study (MultiLocus Sequence Type) has allowed the classification of 212 strains of the S. salivarius collection from the DynAMic laboratory in 96 Sequence Types and to reveal the diversity of these strains. Among these, 138 were selected as representative of the diversity of the collection for ulterior studies. PCR research of integrative elements of these strains has shown that more than 70% of these strains present at least one integrative element carrying at least one antibiotic resistance gene. Therefore the diversity of the antibiotic resistance phenotypes observed were able to be correlated to the diversity of the integrative elements found (Tn916, Tn3872, Tn6002, Tn2009, MEGA) or described for the first time (IQ element) in S. salivarius. The diversity and prevalence of the ICE and IME in S. salivarius were characterized within the completely sequenced genomes of 19 strains. This analysis has allowed the detection of 27 ICE belonging to 2 superfamilies (Tn916 and Tn5252) and 4 distinctive families (ICESt3, Tn916, Tn1549 and TnGBS2) which are integrated into 12 different integration sites. The analysis also allowed the detection of 37 IME which are integrated in 7 different sites as well as 10 MEGA elements integrated in two different genes. The study of the ICE of the ICESt3 family which are described for the first time in S. salivarius in this work showed that they are integrated in the site already described (at the 3’ end of the fda gene), but also in 2 new sites (at the 3’ end of the rpsl and rpmG genes). In parallel to these studies, the adhesion capacity of S. salivarius strains to saliva and gastro-intestinal epithelial cells has been studied. The results have shown that adhesion capacity to the saliva of 24 strains are much diversified and strain dependent. Likewise, the capacity of adhesion to gastro-intestinal epithelial cell lines Caco2 and HT29-MTX of 14 of these strains is strain dependent but also cellular line dependent. These results have allowed the selection of the F6-1 strain of which the adhesion phenotype to HT29-MX and HT29-CL16E cells is particularly high and dependent on the secretion of mucus. The study of mutants of this strain has shown that its adhesion capacity is dependent both on some of their surface proteins and on the gastro-intestinal epithelial cell lines. Finally, conjugative transfer experiments of the ICESt3 F6-1 rpsl were performed under different conditions. Its excision capacity has been shown and an in silico analysis indicates that this ICE could be functional. However, no transconjugant has been obtained whatever the tested conditions