Régulation de la dynamique des membranes et du cytosquelette dans la différenciation du mégacaryocyte

• Main Author: Antkowiak, Adrien
• Other Authors: Toulouse 3
• Language: fr
• Published: 2015
• Subjects: Megacaryocyte; Actine; GTPases
• Online Access: http://www.theses.fr/2015TOU30242

Les mégacaryocytes (MK) sont des cellules géantes de la moelle osseuse, précurseurs des plaquettes sanguines. Leur différenciation se caractérise par un accroissement de la quantité de protéines et de membranes pour permettre l'élongation de prolongements cytoplasmiques, les proplaquettes (PPT), qui vont traverser l'endothélium médullaire pour libérer les plaquettes dans le sang. Il est admis que la tubuline joue un rôle essentiel dans l'élongation des PPT. Par contre, le rôle du cytosquelette d'actine reste encore peu clair et controversé. Dans ce contexte, le but de ma thèse a été d'étudier le rôle de l'actine et de ses régulateurs, les GTPases de la famille Rho et les phosphoinositides, dans la formation des PPT. Dans une première partie, j'ai montré que le cytosquelette d'actine était le principal régulateur de la formation du système de membranes de démarcation (DMS) qui constitue le réservoir de membranes nécessaires à la formation des PPT. Par la combinatoire de modèles murins et humains, j'ai montré que la GTPase Cdc42 et ses effecteurs Pak étaient les acteurs principaux de cette régulation. Mes résultats posent clairement les bases du processus de maturation interne des MK. Ainsi, en réponse à la thrombopoïétine, cytokine clé de la mégacaryopoïèse, le MK possède la propriété intrinsèque de se polariser de façon indépendante des contacts avec la niche hématopoïétique, pour former les territoires du DMS au niveau du futur site d'émission des PPT, et des noyaux. L'imagerie confocale en 3D et en FRET a démontré que la GTPase Cdc42 active était associée aux endomembranes. Logiquement, son inhibition pharmacologique induit une désorganisation majeure du DMS, abolissant totalement la formation des PPT. Pak2 intervient dans ce phénomène en aval de Cdc42 et son inhibition affecte également la production plaquettaire. Ces résultats originaux permettent de mieux comprendre la mécanistique physiologique de maturation des MK pour aboutir à une production plaquettaire normale et mettent en lumière d'éventuelles cibles moléculaires des dysfonctionnements observés dans les thrombopénies. En complément de ce travail, nous avons mis en place une collaboration avec l'équipe du Dr B. Nieswandt (University Clinic of Würzburg, Allemagne) qui vise à comparer l'impact de la délétion spécifique dans la lignée mégacaryocytaire des GTPases Rac1, Cdc42 et RhoA, seules ou en combinaison dans les lignées murines KO. Mes résultats valident le rôle central de Cdc42 et mettent en avant une régulation croisée inattendue entre RhoA et cette dernière. Dans une deuxième partie, j'ai abordé le rôle du phosphatidylinositol 5-phosphate (PtdIns5P), dont l'équipe a montré qu'il activait les GTPases Rac1 et Cdc42, et était responsable de l'invasion lymphomateuse en formant des podosomes invasifs. Les contacts avec la matrice extracellulaire (MEC) sont importants pour la différenciation terminale des MK qui forment des podosomes différents selon le type de matrice (fibrinogène ou collagène). J'ai montré que les MK formaient des podosomes linéaires le long des fibres de collagène alors qu'ils sont punctiformes sur fibrinogène. De façon intéressante, on constate un changement de GTPase selon la matrice. Les podosomes formés sur collagène sont riches en Rac1, alors que sur fibrinogène ils portent Cdc42. Par ailleurs, le PtdIns5P est alors un élément central de la structure des podosomes invasifs sur gel comprenant du fibrinogène. Ainsi, lorsque la matrice est proche de celle de l'environnement vasculaire (fibrinogène), on a apparition d'un phénotype invasif mettant en jeu le PtdIns5P et Cdc42, laissant supposer que la signalisation attenante pourrait réguler les contacts et la traversée endothéliale. L'ensemble des résultats obtenus au cours de ce travail de thèse contribue à une meilleure compréhension de la maturation des mégacaryocytes et de leur relation avec l'environnement médullaire et vasculaire pour aboutir à la production de plaquettes fonctionnelles. === Megakaryocytes (MK) are giant cells located in the bone marrow that produce blood platelets. Their differentiation is characterized by an increase in proteins and membranes that leads to the elongation of cytoplasmic protrusions called proplatelets (PPTs). PPTs will cross the medullar endothelium to release platelets in the blood flow. Tubulin plays a major role in PPT elongation. However, the involvement of the actin cytoskeleton remains unclear and controversial. In this context, the purpose of my thesis was to study the role of actin and its regulators, namely the Rho GTPases and phosphoinositides, in PPTs formation. In a first part, I demonstrated that the F-actin was the main regulator of the formation of the demarcation membranes system (DMS), which represents a membrane reservoir for PPTs. Using complementary mouse and human models, I demonstrated that the Cdc42 GTPase and its effector Pak2 were key regulators of this process. My data set the bases of the internal maturation process. I demonstrated that MKs display the intrinsic property of polarizing in response to thrombopoietin, which is the main cytokine regulating megakaryopoiesis, independently of contacts with the hematopoietic niche. Polarization results in the formation of the DMS territory at the future PPTs emission site, facing the nuclei territory. 3D confocal and FRET imaging demonstrated that active Cdc42 was associated with endomembranes. Interestingly, Cdc42 pharmacological inhibition resulted in total DMS disorganization, which completely abolished PPTs formation. In this phenomenon, Pak2 acted downstream of Cdc42 and its inhibition also abrogated platelets production. These data shed new light on MK physiological maturation that ends in normal platelet production and points to new potential molecular targets that might be dysregulated in thrombocytopenia. We then set up a collaboration with Dr B. Nieswandt's group (University Clinic of Würzburg, Germany) to evaluate the impact of megakaryocytic specific knockout of the Rac1, Cdc42 and RhoA GTPases, alone or in combination, on murine MKs differentiation. My results with these models validate the central role of Cdc42 and demonstrated an unexpected cross-regulation between Cdc42 and RhoA. In a second part, I studied the role of the phosphatidylinositol 5-phosphate (PtdIns5P), which the team demonstrated to activate Rac1 and Cdc42, and identified as a central regulator of lymphoma invasion through elaboration of invasive podosomes. Contacts with the extracellular matrix (ECM) within the bone marrow are instrumental into MKs terminal differentiation. I demonstrated that MKs form linear podosomes along collagen fibers while they form regular dotted structures on fibrinogen. Interestingly, we observed a difference in podosome-associated GTPases according to the matrix. Podosomes formed on collagen were enriched in Rac1, while Cdc42 localized in podosomes when cells were cultivated on fibrinogen. In this case, PtdIns5P that was vesicular in MKs progenitors concentrated in the actin core of those invasive podosomes. Taken together, these data suggest that when the matrix is similar to the vascular environment (fibrinogen), concentration of PtdIns5P and Cdc42 in podosomes might lead to the emergence of the invasive phenotype seen in vitro on fibrinogen-containing gels. An interesting hypothesis regarding the in vivo outcome of this observation is that the PtdIns5P/Cdc42 pathway might be involved in the regulation of MKs contacts with endothelial cells to drive endothelium crossing. Overall, these data shed new lights on MKs maturation and its relationship with medullar and vascular environments that results in production of functional platelets.