Caractérisation de l’activité enzymatique des beta-1,2 mannosyltransférases CaBmt1 et CaBmt3, enzymes d'initiation et d’élongation de la beta-mannosylation du phosphopeptidomannane de Candida albicans

• Main Author: Sfihi-Loualia, Ghenima
• Other Authors: Lille 1
• Language: fr; en
• Published: 2015
• Subjects: Phosphopeptidomannane; Beta-Mannosylation; Analyse structurale; Activité enzymatique; 579.562
• Online Access: http://www.theses.fr/2015LIL10022/document

Candida albicans est une levure de la flore digestive humaine, pouvant dans certaines conditions s’avérer être un pathogène opportuniste. Différents glycoconjugués de la paroi de la levure, en particulier le phosphopeptidomannane (PPM), sont impliqués dans l’interaction hôte-pathogène notamment via des beta-1,2 oligomannosides (β-Mans) terminaux intervenant dans les mécanismes de virulence de la levure. Les travaux de thèse visent à mieux comprendre les voies de biosynthèse des β-Mans par l’étude des enzymes impliquées (CaBmts). Dans ce contexte, la première enzyme étudiée a été CaBmt1, impliquée dans l’initiation de la β-mannosylation du PPM. La stratégie d’étude a consisté d’une part en la préparation d’un panel important de substrats accepteurs potentiels et leur caractérisation structurale par spectrométrie de masse et RMN, et d’autre part à l’étude de l’activité enzymatique de Bmt1p, enzyme recombinante produite chez Pichia pastoris, en présence des substrats naturels et de substrats de synthèse. Nous avons démontré que Bmt1p était capable in vitro de transférer successivement deux résidus de mannose en β-1,2 sur un tri-ou tétramannoside lié en α-1,2. Dans la seconde partie, nous nous sommes intéressés à la caractérisation de l’activité de CaBmt3, enzyme impliquée dans l’élongation des β-Mans du PPM ; la même démarche a été retenue pour l’étude. Les résultats obtenus montrent que Bmt3p transfère in vitro un seul résidu mannose en β-1,2 sur un tétramannoside constitué d’une chaine en α-1,2 avec un mannose terminal lié en β-1,2. L’ensemble de ces travaux sont un préalable à l’élaboration de nouvelles drogues anti-fongiques ciblant la synthèse de la paroi. === Candida albicans is a commensal yeast present in human digestive flora; nevertheless, this opportunistic pathogen may cause severe infections. Several cell wall components including phosphopeptidomannan (PPM) are involved in C. albicans-host cells interaction especially by terminal beta-1,2 oligomannosides (β-Mans) known as implicated in the yeast virulence mechanisms. The aim of our work is to better understand biosynthetic pathways of β-Mans by the characterization of CaBmts individual activities. In this context, the first enzyme to be studied was CaBmt1, involved in the initiation of β-mannosylation of PPM. The strategy is based firstly on the preparation of a large panel of potential acceptor substrates and their structural characterization by mass spectrometry and NMR. On the other hand, the study of enzymatic activity of Bmt1p, a recombinant soluble form produced in Pichia pastoris, was performed in the presence of the natural substrates and synthetic substrates. We established that Bmt1p can sequentially transfer in vitro two -1,2-mannosyl units onto a α1-2 linked tri-or tetramannoside. The second part of this work focused on the characterization of the activity of CaBmt3, the enzyme involved in the elongation of the β-Mans chain on the PPM; the same approach was used for the study. Our results demonstrated that Bmt3p can catalyse the in vitro transfer of one -1,2-mannosyl unit onto a tetramannoside containing a terminal β-1,2-Man linked to a α(1-2)Man chain. These data are a prerequisite for the design of new potential antifungal drugs that target the biosynthesis of cell wall.