| Summary: | Les riboswitches sont des modules structurés dans les régions 5’ (voire 3’) UTR des ARNm. Chaque riboswitch reconnaît spécifiquement un petit métabolite, ce qui provoque un changement de conformation et permet de moduler au niveau transcriptionnel ou traductionnel (voire par épissage alternatif) l’expression d’un gène impliqué dans la synthèse du métabolite.Ce travail portait sur la cinétique de repliement des domaines aptamères de deux riboswitches homologues liant la thiamine pyrophosphate (TPP), un régulant la transcription du gène thiC (E. coli) et l’autre régulant l’épissage alternatif du gène THIC (A. thaliana).La première approche utilisée (méthode cinétique classique par quenched-flow) consistait à sonder la structure des aptamères par des radicaux hydroxyles au cours du repliement initié par l’addition de TPP. Nous avons également développé (coll. avec A.Griffiths), une approche microfluidique visant à remplacer l’appareillage classique et, à terme, de le dépasser en permettant d’augmenter le nombre d’entrées pour l’étude de systèmes complexes. Nous avons aussi utilisé une méthode (kinITC) récemment développée au laboratoire qui permet d’obtenir des informations thermodynamiques et cinétiques inédites par microcalorimétrie isotherme.Nos résultats ont montré que l’aptamère bactérien se replie beaucoup plus vite que celui d’A. thaliana. Cependant, l’aptamère d’A. thaliana étudié dérivait de la forme sauvage (raccourcissement de l’hélice P3). Par comparaison avec d’autres travaux récents, nos résultats soulignent le rôle fondamental de P3 dans la cinétique de repliement. La méthode kinITC a aussi mis en évidence que le régime cinétique du fonctionnement global du riboswitch de E. coli n’est pas contradictoire avec une première étape de fixation du TPP sous régime thermodynamique.Les résultats obtenus avec la nouvelle méthode de microfluidique sont mitigés. Si nous avons pu reproduire le schéma de coupure de l’ARN lié au TPP obtenu par sondage chimique classique (valide ainsi la première étape de ce développement), la cinétique de repliement observée est plus rapide sans que nous en ayons pour le moment une explication satisfaisante. === Riboswitches are RNA modules found in the 5’-UTR of bacterial mRNA where they control gene expression at the transcriptional or translational level. They are occasionally found in the 3’-UTR where they control alternative splicing. Each riboswitch-controlled gene is involved in the biosynthetic pathway of a metabolite and a feedback loop is ensured by the specific binding of the metabolite.To study the folding kinetics of TPP-binding riboswitch aptamer domains from E.coli (regulating transcription of thiC) and from A. thaliana, (regulating alternative splicing of THIC) two different approaches were used. First, each aptamer structure was probed by hydroxyl radical footprinting during RNA folding triggered by TPP . We also developed (coll. with A. Griffiths) a microfluidic approach aimed at replacing the classical quenched-flow apparatus and, eventually, superseding it by giving access to more entries. We also used a method recently developed in our lab (kinITC), which gives access to rich kinetic and thermodynamic information from isothermal titration calorimetry.Our results showed that the E. coli aptamer folds much faster than its A. thaliana counterpart. However, the form that we used for the latter had a helix P3 shorter than that of the wt and, when compared with recent results, our results highlight the fundamental role of this helix in the kinetics of folding. It was also clear that, globally, the E. coli riboswitch is kinetically controlled but the kinITC method allowed us to show that this is not in contradiction with a thermodynamic control of the first TPP binding step.The results obtained with the microfluidic device are mitigated. We were indeed able to make the proof of concept of hydroxyl RNA probing on a microfluidic chip, but the kinetics of RNA folding appeared to be faster than that observed with the quenched flow. We are not yet able to propose an explanation for this strange fact.
|
|---|
