Effet de l'ozone troposphérique sur la physiologie des feuilles de maïs (Zea mays L.) : étude de gènes impliqués dans le catabolisme cellulaire

• Main Author: Ahmad, Rafiq
• Other Authors: Paris Est
• Language: en
• Published: 2012
• Subjects: Ozone; Maïs; Gènes; Catabolisme cellulaire; Cereals; Genes; Cellular catabolism
• Online Access: http://www.theses.fr/2012PEST1018

Le maïs est une plante de culture vivrière commerciale très importante, cultivée partout dans le monde. Sa croissance et les rendements en champ sont affectés par de nombreuses contraintes environnementales. Dans ce travail, l'impact du polluant gazeux phytotoxique, l'ozone, a été étudié sur les feuilles de maïs en utilisant une approche moléculaire et biochimique. Les concentrations en ozone dans la troposphère ont considérablement augmenté dans un passé récent, et actuellement l'ozone affecte clairement les cultures. Un système de fumigation récemment développé à l'INRA a été utilisé pour exposer à l'ozone les maïs en champs de façon contrôlée. Soixante et onze jours après le semis, les plantes ont été soumises à une fumigation d'ozone de 98 ppb.h-1 en moyenne. Les feuilles 10 et 12 ont été récoltées après 20, 35 et 50 jours de traitement. L'expression de trois gènes codant les metacaspases (ZmMCII-1, ZmMCII-2 and ZmMCII-3) ainsi que de leur activité enzymatique globale ont été étudiées lors de la sénescence, et en réponse à l'ozone, dans les feuilles. Pour la première fois, nous avons montré une accumulation significative de l'ARNm des trois metacapases en réponse à l'ozone. Par ailleurs, l'activité enzymatique cellulaire globale des metacaspases est également fortement stimulée dans les deux cas (ozone et sénescence). La surexpression des gènes et la stimulation de l'activité des metacaspases pourraient êtres liés à un ajustement des catabolismes protéiques des feuilles lors de la sénescence et en réponse à l'ozone. Au cours d'autres expériences, les mêmes réponses ont été observées dans le cas de la papaïne-like protéase à cystéine (Mor-CP). De plus, un nouvel inhibiteur des protéases à cysteine, une cystatin a été identifiée dans des feuilles de maïs et a été nommée CC11. L'ADNc complet a été isolé et la protéine recombinante CC11 correspondante a été obtenue et purifiée, à partir d'un système bactérien hétérologue (Vecteur pET30 (EK/LIC) et E. coli BL21 (DE3) plyS). Cette nouvelle cystatine présente une activité inhibitrice optimale vis-à-vis de la papaïne (100%) et très importante (57-80%) vis à vis des protéases à cystéine de feuilles de maïs. Par conséquent, son implication dans la régulation de l'activité des protéases à cystéine en réponse à l'ozone, peut être supposée. Enfin, la production de protéines recombinantes à partir d'ADNc isolés a été réalisée, correspondant aux régions actives de la metacaspase ZmMCII-2 et de la protéase à cystéine Mor-CP. Les anticorps polyclonaux ont été obtenus pour une étude future des événements post-transcriptionels. En conclusion, les protéases à cystéine (caspase-like et papaïne-like) pourraient être utilisées comme paramètres nouveaux pour le criblage de géniteurs dans les programmes d'amélioration du maïs pour la tolérance à l'ozone === Maize is a major crop cultivated all over the world. Its yield and growth is affected by numerous environmental stresses. In the present work, the impact of the gaseous phytotoxic pollutant, ozone, on maize leaves was studied, using a molecular and biochemical approach. Concentrations of ozone in the troposphere have increased dramatically in the recent past and it now negatively affects crops growth and yield. In this work, a recently developed fumigation system was used to expose maize plants in the field. Seventy-one days after sowing, the plants were submitted to ozone fumigation at an average concentration of 98 ppb.h-1. The 10th and 12th leaves were harvested after 20, 35 and 50 days of treatment. Expression of three genes coding caspase-like cysteine proteases “metacaspases” (denoted as ZmMCII-1, ZmMCII-2 and ZmMCII-3) and their global activity was studied in senescent and ozone-exposed maize leaves. For the first time, we observed that mRNA accumulation of the three caspase-like cysteine proteases increased significantly in response to ozone exposure. Moreover, the global activity of metacaspases also increased significantly in both senescencing and ozone-exposed plants. The metacaspases activity and mRNA up-regulation could represent control points for leaf tissues to determine the degree and timing of protein catabolism during senescence and ozone treatment. Protein catabolism was indeed stimulated in response to ozone since increases in the expression of a gene coding an ozone-induced papain-like cysteine protease (Mor-CP) and in global papain-like cysteine proteases activities in leaf tissues were observed. In addition, we identified new cysteine protease inhibitor CC11 “cystatin” in maize leaves. After the recombinant CC11 protein was purified from a bacterial heterologous system (E. coli strain BL21 (DE3) plyS with a pET 30 (EK/LIC) vector), it was shown to be active in vitro against commercial papain (100% inhibition) and against total maize leaf cysteine protease extract (57-80% inhibition). Therefore its involvement in the regulation of cysteine protease activity in response to ozone exposure could be supposed. Production of the recombinant proteins corresponding to the active regions of ZmMCII-2 and Mor-CP was achieved. The corresponding polyclonal antibodies were obtained to study post-transcriptional events in maize leaves, in the future. In conclusion, we have identified the new enzymes, metacaspases and cysteine proteases involved in proteolysis which could be used as novel parameters for screening different maize varieties for improved tolerance to ozone pollution