Optimisation de la technique de BRET : étude de l’association des variants d’HMGA1 avec le diabète de type 2

• Main Author: Marquez, Marcel
• Other Authors: Lille 2
• Language: fr
• Published: 2011
• Subjects: BRET; Rluc8; YPet; RGFP
• Online Access: http://www.theses.fr/2011LIL2S035

La technique de BRET repose sur le transfert d’énergie par résonance de type Förster qui s’opère entre une enzymeluminescente donneuse d’énergie et une protéine fluorescente acceptrice d’énergie par oxydation d’un substrat métabolisable parle donneur d’énergie. Contrairement à bon nombre de techniques d’étude des interactions protéine-protéine, le BRET est noninvasif et permet l’étude dynamique de l’interaction de deux protéines en cellules vivantes ainsi que le criblage de moléculescapables de moduler cette interaction.Dans notre étude, nous avons cherché à optimiser la technique de BRET pour le criblage moléculaire en sélectionnant lemeilleur couple de donneur/accepteur d’énergie. Un nouveau donneur d’énergie, la Rluc8, qui possède des caractéristiqueslumineuses supérieures à la Rluc, a été testé en association avec deux nouveaux accepteurs d’énergie, la YPet, un variant de laYFP optimisé pour le transfert d’énergie, et la RGFP, une protéine fluorescente issue de Renilla reniformis qui est responsableavec la Rluc du phénomène de BRET chez cet organisme marin. === The BRET technique is based on resonance energy transfer has been described by Förster and is based on a luminescentdonor enzyme and a complementary acceptor fluorophore upon oxidation of a donor enzyme substrate. Unlike many techniquesfor the study of protein-protein interactions, the BRET is non-invasive and allows the dynamic study of interaction between twoproteins in living cells and the screening of molecules modulating this interaction.In our study, we sought to optimize the BRET technique for screening assay by selecting the best pair of donor / acceptor.Rluc8, a new donor, with superior light capabilities than Rluc, was tested in combination with two new acceptors, YPET, avariant of YFP optimized for energy transfer, and RGFP, a fluorophore from Renilla reniformis which is involved in theBREAT signal when in contact with Rluc. These new donors / acceptors were compared to the original Rluc / YFP combination,usually used in BRET1, in fusion proteins and in follow-up studies of protein-protein interactions involving GPCRs and βARR2in order to assess their capacity to improve the BRET technique. We were able to show that Rluc8, YPET and RGFP increasedthe sensitivity of the original BRET1 method by increasing at least 2-fold of the BRET signal. These results demonstrate theinterest of these new donors / acceptors in BRET technique and may help improving current follow-up studies of protein-proteininteractions.