Développement de biopuces dédiées au tri d'échantillons cellulaires

• Main Author: Bombera, Radoslaw
• Other Authors: Grenoble
• Language: fr
• Published: 2011
• Subjects: Biopuce; Tri cellulaire; Imagerie SPR; Effet phothothermique; Biomolécules conjuguées; Enzyme de restriction; Biochip; Cell sorting; SPR imaging; Photothermal effect; Biomolecule conjugation; Restriction enzyme
• Online Access: http://www.theses.fr/2011GRENV065/document

Le présent travail de thèse repose sur la conception d'un système miniaturisé de type biopuce capable d'assurer la capture et le relargage contrôlé de différentes populations des cellules sanguines (e.g. lymphocytes). Ce projet a pour objectif la construction d'un outil potentiel de recherche dans le domaine de l'immunologie ainsi que du diagnostic qui permettrait non seulement de réaliser des essais à partir d'une faible quantité d'échantillon, mais aussi de réduire le temps d'analyse. L'approche consiste plus précisément en la fabrication d'une matrice d'oligonucléotides et l'immobilisation de cellules via une molécule hybride composée d'un anticorps IgG couplé à une séquence d'oligonucléotide complémentaire. La synthèse du produit conjugué est mise en place et conduit à l'assemblage functionnel sur biopuce. Une fois les cellules spécifiquement capturées sur la surface, deux voies de rélargage contrôlé sont explorées. Ainsi, les lymphocytes sont libérées de façon contrôlée et séquentielle par clivage enzymatique d'ADN ou alors par désorption physique possible grâce au chauffage localisé. La détection se fait en temps réel par l'imagerie de la résonance plasmonique de surface (Surface Plasmon Resonance Imaging, SPRi) qui présente l'avantage de pouvoir suivre les phénomènes biomoléculaires en absence de marquage et d'apporter une réponse simultanée d'un échantillon biologique sur un grand nombre des sondes. Accessoirement, une approche instrumentale particulière nous permet d'observer les étapes de capture/relargage par microscopie optique classique. La construction de la biopuce permet également l'élargissement à plusieurs cibles et ouvre ainsi la voie à de nombreuses possibilités d'exploration en termes d'application pour l'analyse d'échantillons biologiques plus complexes tels que du sang. === This PhD thesis is devoted to conception of a miniaturized system of biochip type able to realize a controlled capture and release of different populations of the blood cells (e.g. lymphocytes). The main objective of the project is to create a potential tool of research, especially in the field of immunology, and medical diagnostics as well, that could perform short-time analyses by using a small sample amount. The approach relies more precisely on fabrication of a DNA matrix and further immobilization of cells through a hybrid molecule composed of an IgG antibody covalently coupled with short oligonucleotide sequence. Synthesis of the conjugated product is developed and demonstrates functional assembly on the micro-platform. Lymphocytes are specifically addressed onto biochip surface and once they are captured, two independent strategies of selective release are proposed. Therefore, immobilized cells are specifically detached either upon enzymatic cleavage of oligonucleotide substrate or physically desorbed by local heating and denaturation of double stranded DNA. The system makes use of Surface Plasmon Resonance Imaging (SPRi) to enable real time detection of different biomolecular phenomena in a label-free and high-throughput manner. Accessorily, a particular instrumental approach is developed in order to observe cell capture-release steps directly under optical microscopy. The biochip construction permits to extend its performance to many targets and may be further explored in terms of application to analysis of complex biological samples such as blood.