Etude de petits ARN régulateurs chez Helicobacter pylori

• Main Author: Reignier, Jérémy
• Other Authors: Bordeaux 2
• Language: fr
• Published: 2010
• Subjects: Helicobacter pylori; Petits ARN régulateurs; Séquençage haut-débit; Transcriptome; Small regulatory RNA; High-throughput sequencing
• Online Access: http://www.theses.fr/2010BOR21745/document

Ces dernières années de nombreuses recherches ont montré l’importance des petits ARN dans la régulation de l’expression des gènes, chez tous les organismes vivants, des bactéries aux mammifères. Le projet de cette thèse était de recherche et d’identifier des petits ARN chez une bactérie pathogène pour l’homme, Helicobacter pylori (Hp). Cette bactérie colonise exclusivement l’estomac humain, un organe qui pendant longtemps a été considéré comme étant stérile, en raison du pH parfois très acide qui y règne. L’infection persistante de l’estomac humain causée par Hp est associée avec plusieurs pathologies gastriques tels que les gastrites, les ulcères peptiques, les cancers gastriques et les lymphomes du MALT. La moitié de la population est infectée par Hp, qui est responsable d’environ 1 million de décès par an à travers le monde, et de 6000 nouveaux cas de cancers gastrique par an en France. Au cours de ma thèse, j’ai travaillé en étroite collaboration avec le groupe du Pr. Jörg Vogel (RNA Biology, MPI, Berlin, Allemagne) pour développer une méthode rapide et efficace d’analyse du transcriptome complet d’Hp, en s’appuyant sur une nouvelle sur une technologie émergente de pyroséquençage haut-débit (HTPS 454 technology, Life Science, USA). Notre méthode de séquençage du transcriptome d’Hp à partir de banques enrichies en transcrits primaires (dRNA-seq), nous a permis d’identifier les sites d’initiation de la transcription (TSS) de milliers de d’ARN. Plus de la moitié de ces TSS ont été associés à des petits ARN non codants, de courte taille (de 50 à 250 nucléotides en moyenne), qui n’avaient jamais été découverts jusqu’alors, et dont les gènes sont localisés dans des régions intergéniques (sRNA) ou en antisens (asRNA) par rapport aux ORF précédemment annotées dans le génome d’Hp. Nos travaux ont également permis de mettre en évidence une forte activité de transcription antisens sur l’ensemble du génome de la bactérie, un phénomène déjà observé chez E. coli et les eucaryotes. Ainsi, au moins un TSS est localisé sur le brin opposé à 46 % des ORF et à 28% des régions « leaders » des précurseurs des ARNr 23S et 16S, et des ARNt. Enfin, l’approche dRNA-seq a permis l’identification de la première famille de toxines de type I (AapA) identifiée à ce jour chez Hp. Dans ces conditions normales de culture, la traduction de ces toxines est constitutivement réprimée par des petits ARN antisens (IsoA) qui ciblent les ARNm aapA par complémentarité de base. Malgré leur homologie avec des modules toxine-antitoxine identifiés chez d’autres bactéries, pour certaines impliquées dans la réponse aux stress, nous n’avons pas encore découvert les conditions dans lesquelles ces peptides aapA seraient exprimées chez Hp, et leur rôle biologique reste à élucider. === In the past few years, small regulatory RNAs have emerged as an important class of post-transcriptional regulators of gene expression. Indeed they have been identified and/or predicted to exist in all species ranging from bacteria to mammals. The project of this thesis was to search for small non coding RNAs in a human pathogen: Helicobacter pylori (Hp). This bacterium exclusively colonizes the human stomach, an organ that until recently was thought to be sterile due to its extreme acidity. It is now established that persistent colonization by Hp is associated with various gastric pathologies including gastritis, peptic ulcer, gastric cancer and MALT lymphoma. Half of the human population is infected by Hp that is responsible for about 1 million deaths per year and around 6000 cases of gastric cancer in France. During my thesis we , in a close collaboration with the group of Joerg Vogel (RNA biology, MPI, Berlin, Germany) developed a rapid and efficient method to reveal the whole transcriptome of Hp based on recent advances in high-throughput pyrosequencing technologies (HTPS 454 technology, Life Science, USA). By using specifically enriched libraries in primary transcripts, our strategy allowed us to map thousand (1907) of transcription start sites (TSS) on the Hp genome. More than half of these TSS correspond to new short transcripts (non coding RNAs, between 50 and 250 nucleotides in length) that have never been annotated in this genome and that are localized both in intergenic regions (sRNA) and in regions antisense to annotated ORFs (asRNA). Analysis of associations between primary transcription start sites (pTSS) revealed more complexity in the Hp transcriptome than previously anticipated: around one third (27%) of pTSS belong to antisense transcripts (aTSS). The strikingly high degree of antisense transcription occurs, similar to E. coli and higher eukaryotes, across the entire Hp genome. Overall, at least one aTSS is linked to ~46% of all ORFs, ~28% of tRNAs, and the 5’ leaders of 23S and 16S rRNA precursors. Finally our dRNA-seq approach led us to identify the first family of putative type I toxins (AapA) in the Hp genome. Under normal growth conditions these toxins are constitutively repressed by a sophisticated antisense RNA-mediated (IsoA) mechanism. Despite their homology to other toxin-antitoxin modules previously described in other bacteria, we have not found physiological conditions under which these peptides are expressed and have yet to determine the biological significance (if any ?) of these suicide genes.