Flow cytometric analysis of leukocyte surface molecule expression in critical illness:comparison between septic and non-septic patients

• Main Author: Jämsä, J. (Joel)
• Other Authors: Ala-Kokko, T. (Tero)
• Format: Doctoral Thesis
• Language: English
• Published: Oulun yliopisto 2017
• Subjects: C-reactive protein; CD antigens; flow cytometry; intensive care; laboratory tests; leukocytes; lymphocytes; monocytes; neutrophils; procalcitonin; sepsis; systemic inflammation; C-reaktiivinen proteiini; CD antigeenit; laboratoriomerkkiaineet; lymfosyytit; monosyytit; neutrofiilit; prokalsitoniini; tehohoito; valkosolut; virtaussytometria; yleistynyt tulehdusvaste
• Online Access: http://urn.fi/urn:isbn:9789526215778; http://nbn-resolving.de/urn:isbn:9789526215778

Abstract Sepsis is a common problem in the intensive care unit (ICU) still having a high mortality and causing high costs to health care system. Currently, there is no marker to distinguish sepsis from other causes of systemic inflammation. Leukocyte surface molecules have been proposed as markers of sepsis. The most promising markers have been neutrophil CD64 and CD11b on monocytes and neutrophils and HLA-DR on monocytes. In this thesis, leukocyte surface molecules were investigated using quantitative flow cytometry in critically ill patients with sepsis, non-septic ICU controls, and healthy volunteers. The surface molecules of interest were neutrophil CD11b and CD64, monocyte CD11b, CD14, CD40, CD64, CD80, HLA-DR, and lymphocyte CD69. First, a special emphasize was indicated in methodological aspects of the quantitative flow cytometry. Then, the surface molecule kinetics was investigated in different types of critically ill patients. Finally, the diagnostic performance of the molecules was determined and compared to that of traditionally used sepsis markers. Furthermore, an example of multiple marker analysis was introduced as a diagnostic tool. The optimal circumstances for leukocyte surface molecule analysis were +4°C temperature throughout the collection and preparation of the samples using tubes containing acid citrate dextrose (ACD) as an anticoagulant, followed by flow cytometry within 6 hours from sampling. Monocyte CD11b and CD40, neutrophil CD11b and CD64, and CD69 on CD4+ T cells and natural killer (NK) cells separated sepsis from non-septic ICU controls and healthy volunteers, neutrophil CD64, having the best area under curve. Procalcitonin (PCT) was second best marker. Monocyte CD40 and NK CD69 may predict positive blood culture detection, whereas CD11b may predict early mortality. In multiple marker analysis, combination of positive neutrophil CD64, C-reactive protein (CRP) and PCT increased post-test probability for sepsis. In conclusion, pre-analytical and analytical factors have effects on results of leukocyte surface molecule analysis. Leukocyte surface molecules may improve sepsis diagnostics in ICU setting. Neutrophil CD64 was the most promising marker. Combination of CD64, CRP and PCT increased the detection of sepsis in ICU. === Tiivistelmä Sepsis on yleinen tehohoidon ongelma, johon liittyy korkea kuolleisuus ja suuret hoidolliset kustannukset. Toistaiseksi ei ole laboratoriomerkkiainetta, joka erottaisi sepsistä sairastavat muista kriittisesti sairaista, joilla on yleistynyt tulehdusvaste. Valkosolujen pintamolekyylien käyttöä sepsiksen laboratoriomerkkiaineena on tutkittu. Lupaavimmat näistä molekyyleistä ovat olleet neutrofiilien CD64, monosyyttien ja neutrofiilien CD11b ja monosyyttien HLA-DR. Tässä väitöskirjassa tutkittiin valkosolujen pintamolekyylejä kriittisesti sairailla sepsistä sairastavilla potilailla, niillä tehohoitopotilailla, joilla ei ollut sepsistä, ja terveillä vapaaehtoisilla virtaussytometriaa käyttäen. Mielenkiinnon kohteina olivat neutrofiilien CD11b ja CD64, monosyyttien CD11b, CD14, CD40, CD64, CD80 ja HLA-DR, sekä lymfosyyttien CD69. Ensimmäiseksi tutkittiin kvantitatiivista virtaussytometriaa menetelmänä. Sen jälkeen pintamolekyylien kinetiikkaa tutkittiin eri potilasryhmillä. Lopuksi määritettiin pintamolekyylien diagnostinen tehokkuus ja sitä verrattiin perinteisempiin sepsiksen diagnostiikassa käytettyihin laboratoriomerkkiaineisiin. Lisäksi selvitettiin usean merkkiaineen mallin diagnostista osuvuutta. Parhaat olosuhteet virtaussytometrialle olivat: +4 °C:n lämpötila näytteenoton ja -käsittelyn aikana, näytteiden ottaminen putkiin, joissa on antikoagulanttina hapan sitraatti-dekstroosi (ACD) ja näytteiden analysointi kuuden tunnin kuluessa näytteenotosta. Monosyyttien CD11b ja CD40, neutrofiilien CD11b ja CD64 sekä CD4+ T-solujen ja NK-solujen CD69 erottivat sepsistä sairastavat tehohoitoverrokeista ja terveistä. Neutrofiilien CD64:llä oli paras erottelukyky. Prokalsitoniini (PCT) oli toiseksi paras merkkiaine. Monosyyttien CD40 ja NK-solujen CD69 voivat parantaa positiivisen veriviljelylöydöksen havaitsemista, kun taas CD11b voi ennustaa varhaista potilaan menehtymistä. Usean merkkiaineen mallissa neutrofiilien CD64 paransi C-reaktiivisen proteiinin (CRP) ja PCT:n tehoa sepsiksen diagnostiikassa. Loppupäätelmänä on, että valkosolujen pintamolekyylien analysointivaiheen eri muuttujilla on vaikutusta virtaussytometriatuloksiin. Valkosolujen pintamolekyylien käyttö voi parantaa sepsiksen diagnostiikkaa teho-osastolla. Neutrofiilien CD64 oli lupaavin merkkiaine. Neutrofiilien CD64:n, CRP:n ja PCT:n yhdistelmä paransi sepsiksen diagnostiikkaa teho-osastolla.