Optimization of a Multiplex PCR-RFLP Method Used for Detection of Three Primary Mutations in Leber’s Hereditary Optic Neuropathy Patients

• Main Author: Nord, Emilia
• Format: Others
• Language: English
• Published: Uppsala universitet, Institutionen för kvinnors och barns hälsa 2020
• Subjects: LHON; Restriction enzyme; Multiplex PCR; Mutation detection; Mitochondrial mutation; Medical and Health Sciences; Medicin och hälsovetenskap
• Online Access: http://urn.kb.se/resolve?urn=urn:nbn:se:uu:diva-412744

Leber’s hereditary optic neuropathy (LHON) is the most commonly inherited disease that causes blindness in one or both eyes, with a minimum prevalence of 1 in 31 000 in the northeast of England. What causes LHON is not fully known but three mitochondrial mutations, G3460A, G11778A, and T14484C, have been identified in over 95 % of all LHON patients. To diagnose LHON, detection methods like sequencing, allele specific polymerase chain reaction and polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) are used to identify these three mutations. The methods are now evolving into multiplex ones to increase efficiency, the aim of this study was therefore to optimize one of them, a multiplex PCR-RFLP method developed in 2015. This study was however not completed, due to the COVID-19 pandemic, but a series of preparatory steps were performed before its termination. DNA extraction was performed, both genomic and plasmid, using a kit and in-house protocols. The DNA was then used for polymerase chain reactions (PCRs), for both the human β-globin gene and for the three mutations, where magnesium concentration and annealing temperature was optimized. This study resulted in clear, high quality extractions, with the kit as the preferable method. It also indicated that a 3 mM magnesium concentration and an annealing temperature of 59 °C was optimal for all mutations when using so called LHON primers. The conditions for the PCR using the multiplex primers might be different, therefore a new study is required to evaluate the multiplex PCR-RFLP method further. === Bakgrund: Lebers hereditära optikusneuropati (LHON) är en vanlig ärftlig sjukdom som orsakar blindhet. LHON orsakas i över 95 % av fallen av en av tre mitokondriella mutationer, där en byggsten i mitokondriens DNA felaktigt bytts ut mot en annan. Dessa mutationer heter G3460A, G11778A och T14484C. För att diagnostisera sjukdomen detekteras mutationerna, bland annat genom att extrahera DNA från blod, DNA som man sedan skapar otaliga kopior av genom en metod som heter ”polymerase chain reaction” (PCR). Dessa kopior kan sedan klyvas i bitar med hjälp av enzym och baserat på fragmentens storlek kan det avgöras om personen har mutationen eller inte, detta kallas för ”restriction fragment length polymorphism” (RFLP). I nuläget letar man efter en mutation i taget men det har utvecklats några metoder där man kan hitta alla mutationer på en gång och den här studiens syfte var att undersöka hur man på bästa sätt kan utföra en av dessa metoder, en så kallad multiplex PCR-RFLP. Metod: Studien avbröts i förtid på grund av ett pandemiskt utbrott av COVID-19 men hann omfatta DNA-extraktion från humant blod och bakterier med hjälp av ett kommersiellt kit och laboratoriets egna protokoll. Även PCR utfördes för en normal genuppsättning och de tre mutationerna. Resultat och slutsats: Extraktionen gav bra resultat med alla metoder men det kommersiella kitet gav bäst resultat. PCR med det DNA som extraherats fungerade bara ibland vilket gjorde det svårt att dra några större slutsatser, oavsett krävs fler studier för att undersöka metoden eftersom arbetet inte kunde slutföras.